Синтез новых аффинных фотореагентов на основе аналогов ТТР для исследования белково-нуклеиновых взаимодействий

• Автор: Колпащиков, Дмитрий Михайлович
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 121 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СОДЕРЖАНИЕ
ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ФОТОАФФИННАЯ МОДИФИКАЦИЯ КАК ПОДХОД К ИЗУЧЕНИЮ СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИЙ БИОПОЛИМЕРОВ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
1.1. ФОТОАФФИННАЯ МОДИФИКАЦИЯ. ЕЕ МЕСТО В РЯДУ ДРУГИХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОПОЛИМЕРОВ. ЦЕЛИ НАСТОЯЩЕГО ОБЗОРА
1.2. ОСНОВНЫЕ ТИПЫ ФОТОАФФИННЫХ РЕАГЕНТОВ. НЕКОТОРЫЕ ПРИМЕРЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
1.2.1. "Прямые фотосшивки"
1.2.2. Реагенты, содержащие 4-тиоурацил
1.2.3. Нуклеиновые кислоты, содержащие 5-бромурацил
1.2.4. Фотореагенты на основе З-трифторметал-З-аршдиазиринов
1.2.5. Реагенты на основе артазидов
1.3. ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ МЕТОДА
1.3.1. Флеш фотолиз как метод регистрации перестройки конформаций биополимеров
1.3.2. Введение фотореакционноспособных групп в белки
1.3.3. Методы высокоселективного аффинного мечения
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. МАТЕРИАЛЫ
2.2. МЕТОДЫ
2.3. СИНТЕЗ АРИЛАЗИДОВ НА ОСНОВЕ 3-ХЛОР-4-АЗИДО-2Д-ДИФТОРПИРИДИНА
2.4. СИНТЕЗ АНАЛОГОВ ТТР, ЗАМЕЩЕННЫХ ПО 5-ОМУ ПОЛОЖЕНИЮ УРИДИНА
2.5. ФОТОЛИЗ ФОТОРЕАГЕНТОВ
2.6 ИССЛЕДОВАНИЕ СУБСТРАТНЫХ СВОЙСТВ АНАЛОГОВ ТТР
2.6.1. Синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой из Thermus thrmophilus
2.6.2. Проверка субстратных свойств NAB-n-dUTP для ДНК-полимеразы р крысы
2.6.3. Измерение констант Михаэлиса для аналогов ТТР
2.7. ФОТОАФФИННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ДНК-ПОЛИМЕРАЗ
2.7.1. Фотоаффинная модификация ДНК- полимеразы из Thermus thermophilus
2.7.2. Фотоаффинная модификация ДНК-полимеразы Д крысы
2.8. ФОТОАФФИННАЯ МОДИФИКАЦИЯ РЕПЛИКАТИВНОГО БЕЛКА А ЧЕЛОВЕКА
2.9. СЕНСИБИЛИЗИРОВАННАЯ ФОТОМОДИФИКАЦИЯ ДНК-ПОЛИМЕРАЗ

ГЛАВА 3. СИНТЕЗ АФФИННЫХ ФОТОРЕАГЕНТОВ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ МОДИФИКАЦИИ ДНК-ПОЛИМЕРАЗ И РЕПЛИКАТИВНОГО БЕЛКА А ЧЕЛОВЕКА (РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ)
3.1. СИНТЕЗ АНАЛОГОВ ТТР С ВАРИАБИЛЬНОЙ ДЛИНОЙ ЛИНКЕРА МЕЖДУ ОСНОВАНИЕМ И ФОТОАКТИВНОЙ ГРУППОЙ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ СТРУКТУРЫ БЕЛОК-НУКЛЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ
3.1.1. Синтез аналогов ТТР, содержащих 2-нитро-5-азидобензошъный остаток, соединенный с 5-ым положением урацила линкерами различной длины (NAB-n-dUTP)
3.1.2. Исследование субстратных свойств NAB-n-dUTP для эукариотической ДНК-полимеразы /3
3.1.3. ФотоаффиннаямодификацияДНК-полгшеразы /ЗиКРА
3.1.4. Использование аналогов ТТР для идентификации двух конформаций RPA
3.2. ПОВЫШЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ МОДИФИКАЦИИ ПУТЕМ ВАРЬИРОВАНИЯ ПРИРОДЫ АРИЛАЗИДОГРУППЫ
3.2.1. Получение аршазидов на основе 3-хлор-2,4,5,6-тетрафторпиридина
3.2.2. Получение аналогов ТТР, содержащих в качестве реакционноспособных групп З-хлор-4-азидо-2,5-дифторпиридин-6-ил (FAP-7-dUTP, FAP-8-dUTP) и 4-азидо-2,3,5,6-тетрафтор-бензот (FAB-4-dUTP). Исследование га фотохимическга и субстратных свойств
3.2.3. Фотоаффинная модификация ДНК-полгшеразы из Thermus thermophilus с использованием FAP-7-dUTP и FAP-8-dUTP
3.3. ПРИМЕНЕНИЕ БИНАРНОЙ СИСТЕМЫ ФОТОАФФИННЫХ РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ВЫСОКОСЕЛЕКТИВНОЙ МОДИФИКАЦИИ ДНК-ПОЛИМЕРАЗ
3.3.1. Прингщпиальная схема фотосенсибтюированной модификации ДНК-полимераз
3.3.2. Синтез аналога ТТР, содержащего остаток пирена и его субстратные свойства для ДНК-полгшеразы /3 крысы
3.3.3. Фотосенсибшггзированная модификация ДНК-полимераз
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
БЛАГОДАРНОСТИ

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
ТСХ - тонкослойная хроматография
УФ-спектр - ультрафиолетовый спектр поглощения
ЯМР - ядерный магнитный резонанс
РСА -рентгеноструктурный анализ
УФ-свет - ультрафиолетовый свет
ПАГ(Э) - полиакриламидный гель (электрофорез)
ИКК - интеркомбинационная конверсия
НК - нуклеиновая кислота
ДЦК - N.N’-дицикл огексилкарбодиимид
SucONAB - N-гидроксисукцинимидный эфир 2-нитро-5-азидобензойной кислоты
ТЭАБ - триэтиламмонийбикарбонат
ТЭА - триэтиламин
DMF - диметилформамид
dUTP - дезоксиуридин-5'-трифосфат
(d)NTP - (дезокси)нуклеозид-5'-трифосфат
ТТР - тимидин-5'-трифосфат
s4U - 4-тиоурацил
BrU - 5-бромурацил
ТМР - тимидин-5'-монофосфат
Tte ДНК-полимераза - ДНК-полимераза из экстремально термофильной бактерии Thermus
thermophilus В
пол ß - ДНК-полимераза ß крысы
ДНК ПК - ДНК-зависимая протеинкиназа
RPA - репликативный белок А человека

фтора в орто- и пара- положениях к азидогруппе стабилизируют синглетный фенилнитрен (увеличивают время его жизни с 0.1 не для фенилнитрена до 10 не для пентафторфенилнитрена), делая его основной реагирующей частицей [75, 76]. Некоторые аминокислоты, дающие ковалентные сшивки с частицами, образующимися из арилазидов после облучения, указаны в таблице 1.
Рис. 9. Реакции синглетного (а) и триплетного (б) арилнитренов (Я.*-электроноакцепторная группа).