Флуоресцентная метка-якорь в структурном анализе олигосахаридов и изучении углеводсвязывающих белков

• Автор: Шилова, Надежда Владимировна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 127 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

Принятые сокращения

Введение

Обзор литературы

Глава 1. Флуоресцентные метки для анализа моно и олигосахаридов

Глава 2. Общие представления о микрочипах

Экспериментальная часть

Оборудование и реактивы

Методы

Результаты и их обсуждение

1. Бифункциональные флуоресцентные метки

2. Выбор метода отщепления олигосахаридов.
3. Установление структуры ГшосС1уолигосахаридов, выделенных из и АГП 4.2АР как бифункциональная флуоресцентная метка
5. Гликочип
6. Оптимизация иммунофермеитпого анализа
7. Сравнение трех платформ для изучения углеводсвязывающих белков
Заключение
Выводы
Список литературы


Шиффа, образующегося при взаимодействии альдегидной группы сахарида с амином. В качестве восстанавливающего агента чаще всего используют циаиоборгидрид натрия, поскольку с его помощью можно избирательно восстановить основание Шиффа в присутствии альдегида 3. В качестве флуоресцентных заместителей при электрофоретическом разделении удобно использовать отрицательно заряженные метки. Как правило, это ароматические аминосульфокислоты табл. При использовании такого типа меток, достигается хорошая степень разделения особенно при использовании двумерного картирования, метка ЛЭТБ4 46, и высокая пикомоли чувствительность. Восстановительное амипирование сахаридов аминосульфокислотами характеризуется высокими выходами до 7, однако отмечено, что остатки ацетилгалактозамина и ацетилглюкозамина модифицируются существенно хуже остальных моносахаридов выходы не более 7. Полные названия меток и реатгтов см. В работе 9 был предложен микрометод анализа гликопротеиновых гликанов, основанный на дегликозилировании гликопротеинов с последующим флуоресцентным мсчением образующихся сахаридов табл. Анализ меченых олигосахаридов проводился методом высокоэффективного электрофореза с использованием ДНКсеквенатора, который позволяет проводить анализ в пикомоляриом диапазоне. Для изучения активности гликозилтрансфераз методом ПАГЭ авторы работ , использовали пронзводные сахаридов табл. Этот реагент интересен тем, что его конденсацию с углеводами проводят не в кислых 4. В качестве флуоресцентных меток используются также и нейтральные молекулы. Заметим, что для высокочувствительного разделения олигосахаридов методами ПАГЭ или КЭ сахарид либо должен иметь собственный заряд, либо электрофоретическая буферная система должна содержать боратионы . Например, применяют конъюгацию сиалилироваиных сахаридов, нейраминовой кислоты и нейтральных моно и олигосахаридов с 2аминоакридоном с последующим разделением полученных производных методом ПАГЭ . В описанных условиях реакции мечения табл. Авторы работы использовали 5аминофлуоресцеии и дансилэтилендиамин табл. Применяли их и для анализа сиаловых кислот, в которых предварительно генерировали альдегидную группу по реакции периодатиого окисления адиольной группировки. Для разделения и анализа нейтральных олигосахаридов с различной степенью полимеризации методом КЭ иногда применяют 2аминопиридин ,. Следует отмстить, что ПАГЭ и КЭ чаще всего используют как методы разделениядетекции при изучении активности гликозидаз с использованием флуоресцентномеченых моно, ди, три и тетрасахаридов, а также для разделения смесей олигосахаридов, выделенных из природных объектов. Однако есть работы, в которых разработаны чувствительные методики и для установления моносахаридного состава олигосахаридов указанными методами 8, . Так, для анализа моносахаридного состава методом высокоэффективного КЭ авторы сравнили гетероциклических ароматических амина пиримидинового и пиразинового ряда, а также 2аминопиридин. Сравнение проходило по нескольким параметрам интенсивность флуоресценции, зависимость ее от , устойчивость образующихся производных, и т. В результате авторы выбрали 2аминоЗфенилпиразин табл. С помощью этой метки был определен моносахаридный состав бычьего сывороточного фетуина. Большое количество работ посвящено разделению и анализу 2аминопиридиновых производных сахаридов с использованием метода ВЭЖХ табл. Условия введения 2АР в молекулу олигосахарнда значительно разнятся от работы к работе меняется восстановитель, продолжительность и температура реакции, соотношение реагентов , , . Почти во всех работах рекомендуется очистка продукта от избытка исходных реагентов, что не всегда удобно, особенно при анализе микроколичеств вещества. Тем не менее, в виде 2АРироизводных проанализировано огромное количество олигосахаридов, в первую очередь, Ицепей гликопротеинов . Было охарактеризовано много новых нейтральных и сиалоолигосахаридов разработаны методы не только двумерного , , но и трехмерного картирования аминопиридиновых производных олигосахаридов .