Выделение, установление структуры и изучение биологической активности ааптаминовых алкалоидов из губки Aaptos sp.

• Автор: Дышловой, Сергей Анатольевич
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Владивосток
• Количество страниц: 145 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
1. ВВЕДЕНИЕ
2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
Морской алкалоид ааптамин и его аналоги. Особенности их химического строения, биологическая активность. Клеточные культуры и некоторые методы, примененные для изучения биологической активности
2.1. Химическая структура и биологическая активность ранее выделенных аналогов ааптамина
2.1.1. Ааптаминовые алкалоиды, выделенные из природных источников

2Л.2. Попытки использовать ааптамин в качестве таксономического
маркера губок семейства 8иЬегМйае
2.1.3. Возможное бактериальное происхождение ааптаминовых
алкалоидов
2Л.4. Биологическая активность ааптаминовых алкалоидов
2.1.4.1. Влияние на активность ферментов
2.1.4.2. Противовирусная активность
2.1.4.3. Противомикробная активность
2.1.4.4. Цитотоксическая активность
2.1.4.5. Антагонистическая по отношению к а-адренорецепторам и гипотензивная активности
2.1.4.6. Противообрастательная активность
2.1.4.7. Мутагенная активность
2.1.4.8. Ингибирование ХМБА-рецептора
2.1.4.9. Ингибирование активности протеасом
2.1.4.10. Антидепрессантная активность
2.1.4.11. Антиоксидантная активность
2.2. Клеточные культуры и некоторые методы, применённые для изучения биологической активности ааптаминовых алкалоидов
2.2.1.1В6 Р+ С141 клетки как модель для изучения каицерпревентивных веществ
2.2.2. Опухолевые половые клетки
2.2.2.1. Аберрантное развитие и опухоли половых клеток
2.2.2.2. Клеточные линии 1ЧТ2 и 1ЧТ2-К
2.2.2.3. Лечение тестикулярной карциномы на основе применения цисплатина
2.2.3. Протеомика и методы, в ней применяемые
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
3.1. Выделение и установление химического строения ааптаминовых
алкалоидов
3.2. Изучение биологической активности выделенных алкалоидов
ааптаминового ряда
3.2.1. Цитотоксическая активность
3.2.2. Канцерпревентивная активность ааптаминовых алкалоидов
3.2.3. Влияние исследуемых алкалоидов на фосфорилирование МАРК ЕШСв
3.2.4. Исследование влияния алкалоидов ааптаминового ряда на АР-1-, ХЕкВ- и р53-зависимую транскрипционную активность
3.2.5. Исследование влияния ааптамина на 1ЧТ2 опухолевые клетки человека
3.2.5.1. Влияние ааптамина на способность к пролиферации и жизнеспособность N12 опухолевых клеток человека
3.2.5.2. Исследование про-апоптотической активности ааптамина
3.2.5.3. Исследование влияния ааптамина на клеточный цикл в NT2 клетках
3.2.5.4. Выявление белков, регулируемых под действием нецитотоксических концентраций ааптамина в N72 клетках
3.2.5.5. Исследование белков, регулируемых под действием ааптамина в №Г2 клетках
З.2.5.5.1. Анализ экспрессии соответствующих генов

3.2.5.5.2. Анализ экспрессии белков методами Вестерн-блоттинга и 20-Вестерн-блоттинга
3.2.5.5.3. Исследование изменений, происходящих с белком eIF5A
3.2.5.5.3.1. Доказательство увеличения экспрессии гипузинированной формы белка eIF5A под действием ааптамина на NT2 клетки
3.2.5.5.3.2. Эксперимент по включению 3Н-спермидина
3.2.5.5.3.3. Исследование влияния ааптамина на уровень содержания ферментов DHS и DOHH в NT2 клетках
3.2.5.5.3.4. Исследование влияния ааптамина на активность фермента DHS in vitro
3.2.5.5.3.5. Исследование влияния сверхэкспрессии деоксигипузин синтазы (DHS) на скорость роста NT2 клеток73
3.2.5.5.3.6. Исследование эффекта ингибитора протеасом MG-132 на процесс гипузинирования белка eIF5A в NT2 клетках75
3.2.5.6. Обсуждение результатов исследования белков, регулируемых под действием ааптамина в NT2 клетках
3.2.6. Механизмы канцерпревентивного и цитотоксического действия ааптамина
3.2.7. Исследование действия ааптаминовых алкалоидов на цисплатин-устойчивые опухолевые клетки (NT2-R)
3.2.7.1. Сравнение действия ааптаминовых алкалоидов на
чувствительные (NT2) и цисплатин-устойчивые опухолевые клетки (NT2-R)
3.2.7.2. Изучение индукции апоптоза ааптамином, деметилоксиааптамином и изоааптамином в NT2-R клетках
3.2.7.3. Выявление белков, регулируемых в NT2-R клетках под действием ааптамина
3.2.7.4. Выявление белков, регулируемых в NT2-R клетках под действием деметилоксиааптамина

выздоровления достигает 80%, при использовании комбинированной химиотерапии с применением цисплатина [69]. Такой высокий процент излечения объясняется чувствительностью клеток ОСТ к ДНК-повреждающим агентам, связанной с характеристиками этих клеток, а также с их происхождением. Так, эмбриональные стволовые клетки с повреждённой ДНК, похожие по характеристикам на клетки ]МТ2, претерпевают репарацию или апоптоз, таким образом, защищая и сохраняя правильную генетическую информацию, что особенно важно на ранних этапах развития организма [60].
Несмотря на высокий процент излечения, устойчивость к терапии развивается у 10-30% пациентов с метастазироваными несеминоматическими ОСТ II типа (к которому относятся клетки МТ2) [70]. Процесс развития устойчивости к цисплатину до настоящего времени все еще плохо изучен и, по всей видимости, является многофакторным [71].
Основанная на цисплатине терапия имеет ряд побочных эффектов, среди которых возможная нефротокеичность, подавление функции костного мозга и нейротоксичность, которая может развиваться в разных формах, включая нейросенсорную, нейромоторную, нейропатию и ототоксичность [68]. Основные усилия исследователей в области лечения ОСТ сейчас направлены на разработку альтернативных терапий с меньшей токсичностью.
2.2.3. Протеомика и методы, в ней применяемые
Протеом был определён Вилкенсом как набор соответствующих белков, экспрессируемых геномом клетки или ткани в данный момент [72]. В отличие от генома, протеом является высокодинамичным и вариабельным, он зависит от физиологического и патологического состояния организма [73].
Помимо изменения общего количества того или иного белка под действием каких-либо факторов, протеомика позволяет также идентифицировать такие пост-трансляционные модификации белков, как фосфорилирование, гликозилирование, ацетилирование, деаминирование, убиквитинирование и другие [74]. Основными методами, применяемыми при протеомических исследованиях, являются двумерный электрофорез в полиакриламидном геле и масс-спектрометрия. Двумерный электрофорез проводится с целью разделения белков, с последующим