Функциональная экспрессия кДНК и иммуногистохимическое исследование гуанилатциклазы в сетчаткe быка

• Автор: Соловьева, Ольга Владимировна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 122 с. : ил.

Оглавление.
ВВЕДЕНИЕ
1. РАЗЛИЧНЫЕ ТИПЫ ГУАНИЛАТЦИКЛАЗ: СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ
(ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
1.1. Введение
1.2. ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКАЯ ФОРМА ГУАНИЛАТЦИКЛАЗЫ
1.2.1. Структура растворимых гуанилатциклаз
1.2.2. Роль тема - простетической группы гуанилатциклаз
1.2.3. Взаимосвязь состояния олигомеризации с ферментативной активностью белка
1.3. МЕМБРАННЫЕ ФОРМЫ ГУАНИЛАТЦИКЛАЗ
1.3.1. Полипептидрегулируемые гуанилатциклазы
1.3.1.1. GC - рецепторы натрийуретических пептидов
1.3.1.2. GC, активируемая бактериальными термостабильными энтеротоксинами
1.3.1.3. GC, активируемая пептидами из икры морского ежа
1.3.2. Гуанилатциклазы, стимулируемые кальцием
1.3.2.1. Гуанилатциклазы фоторецепторных клеток
1.3.2.2. Белки - активаторы гуанилатциклаз фоторецепторных клеток
1.3.2.2.1. Гуанилатциклаз-активирующие белки (GCAP)
1.3.2.2.2. Кальций зависимый гуанилатциклаз-активирующий белок
1.3.2.3. GC из Tetrahymena и Paramecium
1.3.3. GC, регулируемые G- белками
1.3.3.1. Мускарин-регулируемая GC
1.4. СТРУКТУРА МЕМБРАННОЙ ФОРМЫ ГУАНИЛАТЦИКЛАЗЫ
1.4.1. Зависимость каталитической активности мембранных форм гуанилатциклаз от состояния олигомеризации
1.4.2. Регуляция каталитической активности мембранных форм гуанилатциклаз
1.4.2.1. Функционирование протеинкиназоподобного домена мембранных гуанилатциклаз
1.4.3. Фосфорилирование мембранных форм гуанилатциклаз
2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
2.1. Введение
2.2. Экспрессия фрагмента кДНК гена гуанилатциклазы В в клетках Escherichia coli
2.2.1. Получение экспрессирующих конструкций, содержащих фрагмент кДНК гена
гуанилатциклазы В
2.2.2. Экспрессия фрагмента кДНК гена гуанилатциклазы В в клетках Е. соИ,
идентификация и выделение рекомбинантного продукта
2.2.3. Рефолдинг солюбилизированного рекомбинантного белка гуанилатциклазы В
2.2.4. Определение ферментативной активности рекомбинантного белка
2.2.5. Аналитическая гель-фильтрация рекомбинантного белка
2.3. Экспрессия фрагментов кДНК гена гуанилатциклазы В в эукариотической
системе РкМа ра&от
2.3.1. Создание конструкций на основе челночного вектора рШЪ-Б 1, экспрессирующих СЮ-В
2.3.2. Селекция и отбор трансформантов
2.3.3. Анализ рекомбинантных клонов РгсЫарах1опя
2.3.4. Отбор мультикопийных клонов
2.3.5. Выявление мРНК рекомбинантной гуанилатциклазы В
2.3.6. Экспрессия фрагментов кДНК гена гуанилатциклазы В в дрожжах РгсЫара$(оИя, выделение и очистка рекомбинантных белков
2.4. Свойства рекомбинантных белков ОС-Вр и вС-В§
2.4.1. Определение гуанилатциклазной активности рекомбинантных белков
2.4.2. Гуанилатциклаза В является представителем семейства Бег/Тйг протеинкиназ
2.5. Локализация гуанилатциклазы В в клетках сетчатки глаза быка
2.5.1. Получение поликлональных антител к гуанилатциклазе В
2.5.2. Иммуногистохимическое исследование срезов сетчатки глаза быка
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3.1. Материалы
3.1.1. Реактивы
3.1.2. Ферменты
3.1.3. Штаммы и плазмидные векторы
3.1.4. Микробиологические среды и буферы
3.1.4.1. Микробиологические среды
3.1.4.2. Буферные растворы для ферментов модификации ДНК
3.1.5. Другие растворы

3.1.6. Фотографические растворы
3.2. Методы
3.2.1. Приготовление агарозного геля
3.2.2. Выделение плазмидной ДНК клеток Д
3.2.3. Рестрикция фрагментов ДНК
3.2.4. Получение компетентных клеток Д
3.2.5. Трансформация компетентных клеток Д
3.2.6. Определение нуклеотидной последовательности кДНК секвенированием по
методу Сэнгера
3.2.6.1. Приготовление препаратов плазмид-матриц для секвенирования
3.2.6.2. Реакция секвенирования
3.2.7. Электрофорез белков
3.2.7.1. Приготовление образца
3.2.7.2. Условия проведения электрофореза
3.2.8. Электроблотинг белков
3.2.9. Клонирование кДНК гуанилатциклазы В и определение ее нуклеотидной последов ательности
3.2.10. Экспрессия фрагмента кДНК гуанилатциклазы В в клетках Д
3.2.11. Очистка рекомбинантного белка
3.2.12. Аналитическая гель-фильтрация
3.2.13. Выделение тотальной РНК из сетчатки глаза быка
3.2.13.1. Синтез первой цепи кДНК
3.2.14. Приготовление компетентных клеток Р. pastoris
3.2.15. Трансформация клеток Р. pastoris методом электропорации
3.2.16. Выделение геномной ДНК дрожжей Р. pastoris
3.2.17. Анализ рекомбинантных клонов Р. pastoris методом ПЦР
3.2.18. Выделение тотальной РНК дрожжей Д. pastoris
3.2.19. Синтез первой цепи к ДНК
3.2.19.1. Постановка полимеразной цепной реакции на гибридной матрице мРНК/ДНК
3.2.20. Экспрессия фрагмента кДНК гуанилатциклазы В в дрожжах Р. pastoris, очистка
рекомбинантного белка
3.2.21. Измерение ферментативной активности

поэтому являющуюся вероятным участком связывания АТР [81, 82, 154]. Первичная структура ПКПД имеет более высокое сходство с Tyr-киназами, чем Ser/Thr-киназами.
1.4.1. Зависимость каталитической активности мембранных форм гуанилатциклаз от состояния олигомеризации
Необходимость формирования гетеродимера для проявления ферментативной активности у растворимых GC уже обсуждалась выше. Однако для мембранных форм фермента четкой корреляции между активацией фермента, димеризацией и связыванием лиганда не показано. Исследования в основном сосредоточены на изучении зависимости состояния агрегации и циклазной каталитической активности GC-A и GC-C и, хотя результаты варьируются, имеются косвенные данные в пользу того, что для активации белка обязательна олигомеризация. Считается, что димеризация является лигандзависимой, т.е. происходит в ответ на связывание внеклеточным доменом лиганда. Существует две модели, описывающие предположительные механизмы этого процесса. Согласно первой модели, взаимодействие лиганда с внеклеточным доменом изменяет конформацию этого участка белка, что приводит к димеризации внеклеточных доменов, что в свою очередь ведет к димеризации уже внутриклеточных участков GC с последующей ее активацией [156, 157]. В другой модели предполагается, что движущим механизмом димеризации после связывания лиганда является движение трансмембранного участка, который возможно представляет собой жесткую а-спираль [158].
И в неактивированном состоянии мембранные формы GC могут существовать в виде олигомеров. Размер олигомеров пока точно не установлен, и он, возможно, варьируется от рецептора к рецептору. Электрофорез в смешанном полиакриламид/агарозном геле частично очищенной GC-А из коры надпочечника быка,