Влияние паратиреоидного гормона на кроветворные и стромальные клетки-предшественники

• Автор: Свинарева, Дарья Анатольевна
• Шифр специальности: 14.00.29
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 127 с. : ил.

1 Актуальность проблемы.

2 Цель работы

3 Основные задачи

4 Научная новизна и практическое значение работы

5 Материалы и методы исследования

6 Основные положения, выносимые на защиту

7 Содержание работы по главам

8 Благодарности

Глава 1. Обзор литературы

1 Ниша для стволовых клеток

1.1 Ниша для кроветворных клеток.

1.2 Основные свойства стволовых кроветворных клеток и их регуляция.
1.2.1 Схема кроветворения.
1.2.2 Регуляция самоподдержания и дифференцировки СКК.
2 Мезенхимальная стволовая клетка
3 Функции паратиреоидного гормона
3.1 Свойства паратиреоидного гормона.
3.2 Роль ПТГ в регуляции клеток стромы и гемопоэза
Глава 2. Материалы и методы.
1 Животные и их содержание.
2 Условия облучения животных и культур клеток
3 Получение клеток костного мозга здоровых доноров.
4 Пассирование клеток костного мозга человека
5 Длительные культуры костного мозга Декстеровского типа
5.1 Получение длительной культуры костного мозга мыши
5.2 Получение длительной культуры костного мозга человека
6 Определение количества КООБ
7 Получение и анализ КОЕС.
8 Определение количества КОЕГМ агаровая культура клеток из суспензионной
фракции ДККМ
9 Определение количества КОЕК колоний в метилцеллулозе
Определение интенсивности пролиферации предшественников разной степени
зрелости.
Проверка функционального состояния подслоев ДККМ после воздействия ПТГ.
.1 Определение частоты кроветворных клетокпредшественников после
культивирования клеток КМ на предварительно обработанных ПТГ подслоях ДККМ
.2 Определение изменения количества ниш выживания КООБ после кратковременного культивирования клеток КМ на предварительно обработанных ПТГ подслоях ДККМ
.3 Сравнение способности стромальных подслоев, предварительно обработанных ГТГ, поддерживать рост КООБ
.4 Проверка способности клеток подслоя ДККМ формировать очаг эктопического кроветворения.
Режим обработки мышей ПТГ
Получение очагов эктопического кроветворения.
Метод конкурентной репопуляции.
Определение фактора оседания Ф СКК в КМ и селезенке.
Подсчет клеток.
Выделение геномной ДИК из селезеночных колоний и клеток подслоя ДККМ.
Выделение РНК из анализируемых клеток
.1 Выделение РНК
.2 Определение количества и чистоты полученной РНК
Анализ геномной ДНК методом полимеразной цепной реакции Г1ЦР.
4 Научная новизна и практическое значение работы.
В данной работе i viv впервые было функционально показано, что применение паратиреоидного гормона ПТГ, приводит к увеличению количества ранних полипотентных стволовых кроветворных клеток СКК в раза, однако не оказывает действия на более поздние мультипотентные стволовые кроветворные клетки. Длительное введение ПТГ снижает способность коротко репопулирующих СКК попадать в костный мозг после трансплантации, чем может объясняться отсутствие экспансии зрелых клеток крови. Аналогичное действие паратгормона наблюдалось в модельной системе кроветворения длительной культуре костного мозга человека и мыши. Добавление ПТГ не влияет на продукцию зрелых клеток, однако число поздних олигопотснтных предшественников увеличивается в 7 раз, а в культурах мышиного костного мозга количество более ранних полипотентных предшественников увеличивается в 0 раз.
Полученные в работе данные выявили, что ПТГ не влияет на мезенхимальные стволовые клетки, отвечающие за перенос кроветворного микроокружения, действуя только на стромальные остеобласты и длительно репопулирующие СКК, что говорит в пользу возможного практического использования ПТГ в качестве фармакологического метода воздействия на СКК и стромальные клетки. На основе поученных данных, в настоящее время, в лаборатории физиологии кроветворения ведется работа по изучению влияния паратиреоидного гормона на стволовые клетки, в модельной системе, доноров и больных гематопролиферативиыми заболеваниями. Результаты работы применяются для изучения повреждений стромального микроокружения у больных апластической анемией вГУГНЦ РАМН.
5 Материалы и методы исследования.
Получение длительных культур костного мозга мыши и человека и функциональные тесты проводились стандартными методами культивирования.
Функциональное состояние клетокпредшественников оценивали методом конкурентной репопуляции и в различных клональных тестах, таких, как подсчет колониеобразующих единиц селезенки на день КОЕС в сублетально облученных мышахреципиентах, подсчет колониеобразующих единиц культуры КОЕК в полужидкой среде, подсчет клеток, образующих области булыжника КООБ, с использованием метода Пломахера. Интенсивность пролиферации клеток
предшественников оценивали по доле клеток, чувствительных к воздействию цитостатиков.
Изменения функционального состояния ниш для кроветворных клеток под действием ПТГ определяли с помощью фактора оседания через часа Ф.
Экспрессию интересующих генов определяли методом обратной транскрипции и последующей полимеразной цепной реакции, полуколичественную оценку продукта реакции проводили с помощью метода Саузернблот гибридизации.
6 Основные положения выносимые на защиту.
1. Паратирсоидпый гормон стимулирует пролиферацию и увеличение количества ранних стволовых кроветворных клеток к которым относятся наиболее примитивные стволовые клетки, способные длительно поддерживать кроветворение.
2. Введение паратиреоидного гормона не влияет на более зрелые мульти и олигопотные клеткипредшественники.
3. Мезенхимальные стволовые клетки не чувствительны к воздействию паратиреоидного гормона.
4. Паратиреоидный гормон изменяет свойства компонентов стромалыюго микроокружения, активирует остеобласты, регулирующие ранние СКК, и модулирует элементы васкулярной ниши, отвечающие за способность более поздних гемопоэтических предшественников находить свое место после трапсплантации.
7 Содержание работы по главам.
Оглавление
Основные обозначения и сокращения
Введение
Глава 1 Обзор научной литературы
Глава 2 Описание методов экспериментальных исследований
Глава 3 Результаты работы
Глава 4 Обсувдение
Выводы
Список использованной литературы


Функциональное состояние клетокпредшественников оценивали методом конкурентной репопуляции и в различных клональных тестах, таких, как подсчет колониеобразующих единиц селезенки на день КОЕС в сублетально облученных мышахреципиентах, подсчет колониеобразующих единиц культуры КОЕК в полужидкой среде, подсчет клеток, образующих области булыжника КООБ, с использованием метода Пломахера. Интенсивность пролиферации клеток
предшественников оценивали по доле клеток, чувствительных к воздействию цитостатиков. Изменения функционального состояния ниш для кроветворных клеток под действием ПТГ определяли с помощью фактора оседания через часа Ф. Экспрессию интересующих генов определяли методом обратной транскрипции и последующей полимеразной цепной реакции, полуколичественную оценку продукта реакции проводили с помощью метода Саузернблот гибридизации. Основные положения выносимые на защиту. Паратирсоидпый гормон стимулирует пролиферацию и увеличение количества ранних стволовых кроветворных клеток к которым относятся наиболее примитивные стволовые клетки, способные длительно поддерживать кроветворение. Введение паратиреоидного гормона не влияет на более зрелые мульти и олигопотные клеткипредшественники. Мезенхимальные стволовые клетки не чувствительны к воздействию паратиреоидного гормона. Паратиреоидный гормон изменяет свойства компонентов стромалыюго микроокружения, активирует остеобласты, регулирующие ранние СКК, и модулирует элементы васкулярной ниши, отвечающие за способность более поздних гемопоэтических предшественников находить свое место после трапсплантации. Содержание работы по главам. Список использованной литературы.