Разработка биотехнологического процесса получения комплексных ферментных препаратов термостабильной α-амилазы и протеазы на основе нового мутантного штамма Bacillus licheniformis 103

• Автор: Костылева, Елена Викторовна
• Шифр специальности: 05.18.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 157 с. : ил

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Протеазы. Классификация, механизм действия и физикохимические свойства

. 1.2. аАмилаза. Физикохимические свойства и механизм действия

1.3. Продуценты щелочных сериновых протеиназ и термостабильной аамилазы.

1.4. Физиологические функции протеаз и аамилазы

1.5. Регуляция биосинтеза протеаз и аамилазы микроорганизмами

1.6. Методы повышения активности штаммов

1.7. Применение щелочных протеиназ, аамилазы и комплексных

препаратов в различных отраслях АПК.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Продуцент и условия хранения посевного материала.
2.2. Методы проведения мутагенеза.
2.3.1. Первый и третий этапы мутагенеза. Получение стрептомициноустойчивых штаммов .iii и .iii 3
2.3.2. Второй этап мутагенеза. Получение штамма .iii К 1
2.4. Условия культивирования продуцента.
2.5. Получение ферментных препаратов
2.6. Методы определения активности ферментов
2.7. Характеристика ферментационных сред
3. ПОЛУЧЕНИЕ ВЫСОКОАКТИВНОГО ШТАММА I 1 I I 3 МЕТОДАМИ МУТАГЕНЕЗА И СЕЛЕКЦИИ. ОПТИМИЗАЦИЯ СПОСОБА ВЕДЕНИЯ ПОСЕВНОГО МАТЕРИАЛА МУТАНТ1ЮГО ШТАММА.
3.1. Мутагенез, селекция.
3.2. Исследование влияния условий хранения и ведения посевного материала на ферментативную активность мутантного штамма В. ИсЬетЪггп1
3.2.1. Исследование морфологической изменчивости штамма В.НсЬетогггпБ 3 при рассеве на разные виды агаризованных сред
3.2.2. Влияние условий хранения посевного материала на ферментативную активность штамма В.ИсЬетопть
3.2.3. Влияние длительности хранения спорового посевного материала на ферментативную активность штамма В.Искетоптз
3.2.4. Влияние способа длительного хранения спорового посевного материала на ферментативную активность штамма В.iii
4. ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ мутантного штамма влаимзиСНЕМВОВММ 3.
4.1. Оптимизация состава питательных сред для глубинного культивирования продуцента.
4.1.1. Культивирование исходного и мутантного штаммов на средах с кормовыми дрожжами и различными источниками углерода.
4.1.2. Выбор оптимального комплексного источника органического азота для глубинного культивирования штамма В.НсНетгпйз
4.1.3. Влияние концентрации кукурузной муки на биосинтез ферментов штаммом ВМсЬеп огпт
4.1.4. Культивирование штамма В.ИскетЪгт1ь 3 на ферментационных средах с различным соотношением кукурузной и соевой муки
4.1.5. Культивирование штамма В.НсИетогпт 3 на ферментационных средах с полной и частичной заменой кукурузной муки пшеничной, ржаной и ячменной
4.1.6. Влияние неорганических источников фосфора на биосинтез ферментов штаммом .iii 3.
4.1.7. Влияние способа ферментативной обработки среды для глубинного культивирования на биосинтез ферментов штаммом .iii 3.
4.2. Влияние условий культивирования на синтез ферментов
штаммом .iii 3.
4.2.1 Влияние температуры культивирования и исходной ферментационной среды на биосинтез ферментов штаммом .iii 3.
4.2.2. Влияние возраста и количества вегетативного посевного материала на синтез протеазы и аамилазы штаммом .iii
4.3. Направленное культивирование продуцента
5. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ШТАММА I II1 3 С ВНЕСЕНИЕМ В КУЛЬТУРАЛЬНУЮ ЖИДКОСТЬ ПОВЕРХНОСТНОАКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ.
5.1. Изучение локализации протеазы
5.2. Добавление поверхностноактивных веществ в качестве индукторов биосинтеза про теазы
5.3. Культивирование штамма .iii 3 с внесением в ферментационные среды промышленных поверхностноактивных веществ.
6. ПОЛУЧЕНИЕ КОНЦЕНТРИРОВАННЫХ ФЕРМЕНТ 1ЫХ ПРЕПАРАТОВ АМИЛОПРОТОЛИХЕТЕРМГХИ ГХ.
7. ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКОХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА АМИЛОПРОТОЛИХЕТЕРМ
7.1. Влияние и температуры на протеолитическую и
ам ил ол итичес кую активность препарата Амипопротолихетерм Гх
7.2. Стабильность протеолитических и амилолитических ферментов штамма .iii 3 при различных значениях и температуры.
7.3. Влияние промышленных поверхностноактивных веществ и 2 щелочных реагентов на протеолитическую и амилолитическую активность препарата Амшопротолихетерм.
7.3.1. Исследование влияния промышленных поверхностноактивных веществ на протеолитическую и амилолитическую активность препарата Амшопротолихетерм Гх.
7.3.2. Исследование влияния промышленных поверхностноактивных веществ на стабильность протеолитических ферментов препарата Амшопротолихетерм Гх.
7.3.3. Исследование влияния щелочных реагентов на стабильность протеолитических ферментов препарата Амшопротолихетерм Гх
8. МАСШТАБИРОВАНИЕ ПРОЦЕССА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ШТАММА I I 3
8.1. Культивирование штамма .iii в лабораторных ферментерах
8.2. Культивирование штамма .iii 3 в полупроизводственных условиях
8.3. Культивирование штамма .iii 3 в условиях МЭЗ
9. ИСПЫТАНИЕ ПРЕПАРАТОВ А МИЛО ПРОТОЛИХЕТЕРМ В
СПИРТОВОЙ И ДРУГИХ ОТРАСЛЯХ ПРОИЗВОДСТВА.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Пептидазы представляют собой ферменты экзодействия, последовательно расщепляющие пептидные связи, ближайшие к аминю или карбоксильному
концу молекулы субстрата, а протеиназы или эндопептидазы расщепляют внутренние пептидные связи, отстоящие далеко от концов молекулы. В зависимости от участка молекулы субстрата, на который они действуют или С конец аминокислотной цепи, пептидазы делят на амино и карбоксипептидазы. Аминопсптидазы или ааминоацилпегггидгидролазы КФ 3. Большинство амин о пептидаз относится к металлоферментам, для каталитического действия которых необходимо присутствие в активном центре ионов таких металлов, как цинк, кобальт, марганец, магний или кальций. Аминопелтидазы обнаружены в различных бактериальных и грибных штаммах В. В основном, данные протеазы являются внутриклеточными ферментами, но известны и внеклеточные амииопептидазы. Аминопегтгидазы грибного и бактериального происхождения сильно различаются по субстратной специфичности. Аминопептидаза 1 из . Да. Она характеризуется широким оптимумом действия от 7,5 до ,5 и для максимальной активности требует присутствия иона 2 или , i , . Аминопептидаза . Она содержит один 2 на моль и ее активность увели чиваегся в присутствии Со2ь. М.м. Со2 . К группе КФ 3. Карбоксипептидазы действуют на Сконец нолипептидпой цепи с высвобождением отдельных аминокислот или дипептидов. Для активности метал локарбокси пептидаз из . Грачева И. М., Кривова А. Ю., , Диксон М. Уэбб Э. В. , . Ферменты группы КФ 3. КФ 3. КФ 3. Сконца Грачева И. М., Кривова А. Ю., , Диксон М. Уэбб Э. Протеиназы или эндопептидазы предпочтительно гидролизуют пептидные связи на внутренних участках полипептидной цепи. Присутствие амино или карбоксильных групп негативно влияет на ферментативную активность. В зависимости от механизма катализа, установленного по функционированию активного центра фермента, а также влияния на его активность, эндопептидазы разделяют на четыре подгруппы сериновыс, аспартиновые, цистеиновые и металлопротеиназы. Для сериновых протеиназ или сериновых эндопептидаз КФ 3. В этот подподкласс внесены многие протеиназы животного происхождения химотрипсин, трипсин, тромбин, плазмин, эластаза и др. Сери новые протеиназы необратимо ингибируются 3,4дихлороизоку марином 3,4I, 3карбоксигранс2,3эпоксипропиллейциламидо 4гуанидин бутаном, фенилметилсульфонилфторидом и тозиллизин хлорметил кетоном . Некоторые сериновые протеиназы ингибируются тиоловыми реагентами, такими как рхлоромеркурийбензоат РСМВ, благодаря наличию остатка цистеина вблизи активного центра. Они имеют широкую субстратную специфичность, включая эстеролитическую и амидазиую активности. Их молекулярные массы варьируют между и кДа. Изоэлектрические точки сериновых протеиназ, в основном находятся между 4 и 6 Грачева И. М., Кривова А. Ю., , Диксон М. Уэбб Э. В. , . Сериновые эндопептидазы включают в себя два семейства эволюционно родственных протеиназ химотрипсины КФ 3. КФ 3. Субтилизины бацилл представляют собой секреторные ферменты, устойчивые и активные в щелочной области . Они обладают широкой субстратной специфичностью, однако преимущественно расщепляют связи, образованные гидрофобными аминокислотами. В аминокислотном составе молекул субтилизинов преобладают гидрофобные аминокислоты и полностью отсутствуют цистин и цистеин Руденская Г. Н., . Все субтилизины обладают характерным способом укладки полипептидной цепи в пространстве. Ядро субтилизина содержит около 0 остатков, образующих 5 параллельных 3цепей, окруженных четырьмя аспиралями i . Субстратсвязывающий карман представляет собой гидрофобную впадину, способную вместить, по крайней мере, 6 аминокислотных остатков субстрата. Расщепляемый пептид образует водородные связи с аминокислотами субстратсвязывающего кармана, ориентируя субстрат таким образом, чтобы Сконцевая группа была направлена в сторону от фермента. Специфичность субтилизинов определяется, главным образом, взаимодействиями между остатками Р4Р1 субстрата и соответствующими остатками субстратсвязывающего центра молекулы фермента В. С. , .