Получение, свойства и применение микробной эндо-1,4-β-ксиланазы

• Автор: Сысоева, Марина Геннадьевна
• Шифр специальности: 05.18.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Воронеж
• Количество страниц: 174 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава I. Характеристика эндо1,43кснланазы.

1.1 Ксиланы зерна злаков структура, состав

1.2 Продуценты эндо1,43ксиланаз.

1.3 Направленный биосинтез эндо1 ЦЗксиланазы.

1.3.1 Влияние состава среды на биосинтез

эндо1,43ксиланазы.

1.3.2. Влияние условий культивирования на

биосинтез эндо 1,43ксиланазы.

1.4 Выделение и очистка препаратов эндо1,43ксиланазы.
1.5 Физикохимические свойства эндо1,43ксиланаз
1.5.1 Молекулярная масса эндо1,43ксиланаз и их структура.
1.5.2 Влияние и температуры на активность
щ. эндо1,43ксиланаз.
1.5.3 Исследования каталитических центров
1.6 Субстратная специфичность действия эндо1,43ксиланаз
1.7 Применение гемицеллюлозолитических ферментных препаратов в пищевой промышленности
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
Глава 2. Материалы н методы исследований
2.1 Объекты исследований.
2.2 Методы определения активности фермента
2.3 Определение количества белка.
2.4 Математическое планирование экспериментов
2.5 Получение технического препарата эндо1,43ксиланазы.
2.6 Гельфильтрация и ионообменная хроматография.
2.7 Фракционирование ферментного препарата методом электрофореза.
2.8 Определение молекулярной массы фермента методом гельфильтрации.
2.9 Определение субъединичной структуры белка
методом электрофореза
2. Тонкослойная хроматография конечных продуктов ферментативного гидролиза ксилана.
2. Анализ состава аминокислот
2. Методы определения показателей солода, сусла и пива.
Глава 3. Исследование биосинтеза эндо1,43ксиланазы ОДгориз
уаг тктоярогия 5
3.1. Получение активного продуцента эндо1,43ксиланазы
3.2 Разработка условий культивирования продуцента эндо1,43ксиланазы Я. уаг гшсгоБрогиБ 5 на твердых питательных средах
3.3 Разработка условий культивирования продуцента эндо1,43ксиланазы Я. уаг писгоэрогиз 5 при
глубинном способе выращивания
Глава 4. Получение препарата эндо1,43ксиланазы
И. уаг писгозрогиз 5 и исследование его физикохимических
свойств.
4.1 Выделение и очистка эндо1,43ксиланазы
4.2. Определение молекулярной массы и субъединичного
строения фермента
4.3 Аминокислотный состав эндо1,45ксиланазы
4.4 Влияние и температуры на активность фермента
4.5 Кислотная и термическая инактивация эндо1,43ксиланазы
4.6 Изучение действия эндо1,42ксиланазы на ксилан.
4.7 Определение константы Михаэлиса эндо1,43ксиланазы.
4.8 Исследование ферментативного гидролиза ксилана
4.9 Идентификация аминокислотных остатков активного центра
Глава 5. Применение ксиланазы в технологии пива
5.1 Исследование влияния различных факторов на качественные показатели пивного сусла
5.2 Разработка технологии получения пивного сусла с применением ксиломикроспорина
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА


Способность к биосинтезу ксиланазы обнаружена у бактерий рода Bacillus [,0,,,] Sfirepfomyces'[1,4,8,2,,]. Так выделен из почвы штамм Bacillus sp. NG-, продуцирующий термостабильную ксиланазу [4]; очищен и исследован фермент из Bacillus polymyxa[ 7], Bacillus stearothermophilus []. Из различных изолятов фруктов была выделена бактерия рода Bacillus, которая продуцировала две ксиланазы с различными физикохимическими свойствами []. Изучена термостабильность ксиланазы Streptomyces halstadii JM8 [3] и кинетические характеристики Streptomyces olivaceoviridis Е- [9]. Активным продуцентом фермента, гидролизующего ксилан, являются Aeromonas caviae МЕ-1[ 5,3]. Из культуры Aureobasidium pullulans var. ATCC 4) выращенной на ксилане, выделена внеклеточная эндоскиланаза. Фермент был очищен и исследованы физико-химические свойства [2]. Грамм-отрицательный облигатный анаэроб Bacteroides ovatus, продуцирующий ксиланазу, способен использовать ксилан в качестве единственного источника углерода [7]. Учеными из Индии исследован биосинтез ксиланазы Bacillus SSP-, подобран состав питательной среды, температура, pH, количество инокулята, эффективность аэрации [6]. Thermomonospora fusca [5], Clostridium cellulovorans [6]. С целью дальнейшего использования для гидролиза бумажной пульпы изучен термофильный, щелочеустойчивый фермент из Bacillus stearothermophilus Гб[1], Streptomyces roseiscleroticus NRRL B-1J9[], Bacillus circulans AB []. Проведена очистка и изучены физико-химические свойства ксиланазы Acrophialophora nainiana []. Исследована ксиланаза мутанта PN-0 Cellulomonas flavigena, которая явлась кислым белком с р1 6. Сравнительно малоизученной группой микроорганизмов в отношении образования ксиланаз являются дрожжи. Обнаружена способность дрожжей Saccharomyces cerevisiae синтезировать фермент [3, ]. Изучена динамика изменения активности ксиланазы при росте дрожжей Cryptococcus podzolicus. Показано, что фермент имеет внеклеточную локализацию, установлен индуцибельный характер биосинтеза ксиланазы []. Известен также актиномицет Chainia sp. NCL . Продуцентами ксиланаз также являются базидиальные грибы Coriolus pubescens IBR3, Lentinus tigrinus IBR0, Pholiota aurivella IBR7 и Gloeophyllum saepiarium IBR5 [], Panus tigrinus [1]. Анализ литературных данных показал, что дрожжи, различные микромицеты, бактерии, в том числе актиномицеты образуют в основном внеклеточную ксиланазу, что упрощает процесс выделения и очистки фермента. В настоящее время эндо-1,4-/3-ксиланазы микробного происхождения вызывают большой интерес из-за возможности их применения в пищевой и микробиологической промышленности. Направленный биосинтез эндо-1,4-? Культивировать микроорганизмы с целью получения ферментов можно поверхностным и глубинным способами. Глубинное культивирование на жидких питательных средах находит широкое применение как наиболее перспективный способ, обладающий преимуществами с точки зрения автоматизации и высокого санитарно-гигиенического уровня производства. Этот способ позволяет вести процесс в непрерывном режиме, при котором обеспечивается генетическая стабильность микроорганизмов. Преимуществами твердофазного культивирования являются возможность использования крупнодисперсных субстратов, которые обеспечивают высокий уровень аэрации, тепло- и масообменных процессов в культуре. Микроскопические грибы при твердофазном культивировании имеют истинно мицелиальный рост, высокую скорость синтеза белка и выход фермента. Мицелий не повреждается механически, как это имеет место в глубинной культуре. Наконец, готовая культура имеет низкую влажность, что обеспечивает получение препаратов с минимальными энергозатратами при удалении влаги []. Все ферменты, продуцируемые микроорганизмами, подразделяются на индуцибельные и конститутивные. Первые обычно присутствуют в клетке в ничтожно малых количествах, но их концентрация может резко возрасти в присутствии в среде специфических индукторов. При этом отдельные компоненты питательной среды могут специфически усиливать биосинтез одних ферментов, не влияя или подавляя биосинтез других [].