Разработка ИФА-тест системы для диагностики и мониторинга чумы мелких жвачных животных

• Автор: Джумаев, Шухрат Нурмуродович
• Шифр специальности: 06.02.02, 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 119 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ стр.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Краткая характеристика ЧМЖЖ.

1.2. Лабораторные методы диагностики ЧМЖЖ

1.3. Конкурентные методы ИФА.

1.3.1. Неконкурентные методы ИФА.

1.3.2. Твердофазный носитель для ИФА.

1.3.3. Иммуноферментные коныогаты

1.3.4. Принципы получения диагностических сывороток

1.3.5. Принципы приготовления антигенов
1.4. Заключение по обзору литературы.
ГЛАВА 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2. Материалы и методы
2.1.1. Материалы
2.1.1.1. Вирусы
2.1.1.2. Животные
2.1.1.3. Диагностические антигены и сыворотки
2.1.1.4. Контрольноиспытуемые пробы.
2.1.1.5. Культуры клеток.
2.1.1.6. Химические реактивы и биопрепараты
2.1.1.7. Растворы и их приготовление.
2.1.1.8. Аппараты и лабораторное оборудование
2.1.2. Методы
2.1.2.1. Приготовление вируссодержащего органотканевого материала
2.1.2.2. Инфицирование культур клеток и получение вируссодержащего культурального материала
2.1.2.3. Электронная микроскопия штамма Темурмалик вируса ЧМЖЖ.
2.1.2.4. Постановка и учет результатов серологических реакций
2.1.2.5. Концентрирование биологических препаратов и определение концентрации белка
2.1.2.6. Лиофильная сушка препаратов.
2.1.2.7. Статистическая обработка результатов
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
3.1. Выделение эпизоотического штамма Темурмалик вируса ЧМЖЖ для приготовления диагностических препаратов
3.2. Приготовление культурального антигена для ИФА при ЧМЖЖ и гипериммунизации животных.
3.2.1. Изучение оптимальных условий культивирования вируса ЧМЖЖ в культуре клеток температура, сроки культивирования, заражающая доза
3.3. Приготовление специфических и нормальных антигенов при ЧМЖЖ.
3.4. Получение специфических сывороток при ЧМЖЖ
3.5. Получение видоспецифических сывороток.
3.6. Приготовление и контроль иммунопероксидазных конъюгатов
для ИФЛ при ЧМЖЖ
3.7. Проверка активности диагностических препаратов после хранения в нативном и лиофилизированном состояниях при температуре от плюс
до плюс 4С.
3.8. Отработка оптимальных условий постановки метода ИФА для выявления антигена вируса ЧМЖЖ.
3.8.1. Отработка процесса сенсибилизации полистироловых плоскодонных плашек вирусспецифическим иммуноглобулином.
3.8.2. Отработка температурновременных условий сенсибилизации полистироловых плоскодонных плашек вирусспецифическим иммуноглобулином
3.8.3. Подбор раствора для сенсибилизации лунок полистироловых плоскодонных плашек вирусспецифическим иммуноглобулином
3.8.4. Отработка температурновременных условий контакта сенсибилизированных плашек с БСА.
3.8.5. Отработка температурновременных условий контакта антигена с сенсибилизированными вирусспецифическим иммуноглобулином полистироловыми плоскодонными плашками
3.8.6. Отработка условий постановки метода ИФА для определения антител
в сыворотках крови животных.
3.8.7. Эффективность применения метода твердофазного ИФА для выявления и идентификации специфического антигена
вируса ЧМЖЖ.
3.8.8. Оценка специфичности, чувствительности и эффективности непрямого варианта ИФА.
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.
5. ВЫВОДЫ
6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
7. БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ УКАЗАТЕЛЬ.
ПРИЛОЖЕНИЯ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АБТС 2,2азинобисэтилбензтиазолин сульфоновая кислота
БСА бычий сывороточный альбумин
ИФА иммуноферментный анализ
Иг иммуноглобулин
КРС крупный рогатый скот
МДВК перевиваемые линий культуры клеток почки коровы МФА метод флуоресцирующих антител мелкий рогатый скот ОП оптическая плотность
ПО перевиваемые линий культуры клеток почки овцы
ПЯ первичнотрипсинизированная культура клеток почки ягненка
ПЭГ полиэтиленгликоль
СП пристеночная питательная среда
ПЦР полимеразная цепная реакция
РДГ1 реакция диффузионной преципитации
РНК рибонуклеиновая кислота
РИА радиоиммуноанализ
реакция нейтрализация
РСК реакция связывания комплемента
РТ Республика Таджикистан
ТЯ тестикул ягненка
ТЦЦ титр цитопатического действия
ЧМЖЖ чума мелких жвачных животных
ЦПД цитопагическое действие
ЦПЭ цитипагический эффект
чистота коньюгата
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Согласно данным МЭБ чума овец и коз в настоящее время распространена по всей территории Центральной Африки, Турции , Ирана, Аравийского полуострова, Индии, Пакистана , Бангладеш, Непала и Афганистана . Экономический ущерб, причиняемый ЧМЖЖ козоводству и овцеводству, велик, особенно в странах, где преимущественно разводят мелких жвачных животных, так как заболеваемость в первичных очагах болезни может достигать 0, при высоком уровне летальности. Кроме того, ЧМЖЖ обуславливает возникновение сопутствующих болезней у животных, что определяет высокий уровень экономических потерь. Для борьбы с этой болезнью необходим точный диагноз, но не всегда это удатся изза схожести с другими болезнями. Своевременная диагностика ЧМЖЖ является важным условием купирования инфекции в первичном очаге. В настоящее время для диагностики ЧМЖЖ применяют различные серологические методы такие как реакция диффузионной преципитации РДП, реакция связывания комплемента РСК, реакция нейтрализации и иммуноферментный анализ ИФА. Р1звестно, что разработанный для диагностики болезни ЧМЖЖ метод ИФЛ применяют во многих странах. Однако в разных странах методы ИФЛ отличаются между собой по многим параметрам и имеют специфические особенности. Принимая вышеуказанное во внимание можно сделать заключение о необходимости разработки ИФА для выявления антигена и антител при ЧМЖЖ. Для широкого применения ИФА для диагностики и серомониторинга требуется разработка и создание универсальных отечественных высокоспецифических диагностикумов. Цель и задачи исследований. Разработать тестсистему для лабораторной диагностики и идентификации антигена вируса ЧМЖЖ и антител к нему. ИФА для обнаружения специфического антигена вируса ЧМЖЖ
разработать оптимальные условия постановки непрямого твердофазного варианта ИФА для обнаружения антител к вирусу ЧМЖЖ. Научная новизна. ЧМЖЖ из очага болезни мелкого рогатого скота в Республике Таджикистан. Выделенный вирус ЧМЖЖ паспортизован и депонирован в коллекции микроорганизмов ДТП Научноисследовательском институте проблем биологической безопасности Республики Казахстан штамм вируса ЧМЖЖ Тсмурмалик для биотехнологических целей. Практическая значимость. Предложен способ изготовления культурального антигена на основе эпизоотического штамма Темурмалик вируса ЧМЖЖ для постановки серологических реакций и гипериммунизации животных. Рекохмендованная схема получения специфической сыворотки на культуральный антиген и антивидовой кроличьей сыворотки, а также методы выделения и очистки из них иммуноглобулинов и аффинноочищенных антител переданы для использования в НИИ Биологические препараты Таджикской Академии сельскохозяйственных наук для налаживания их производства. По результатам исследований разработана и составлена нормативнотехническая документация Дастур оид ба ташхиси озмоишгохии тоуни чорвои хурди шохдор бо усули тахлили иммуноферменти Наставление по лабораторной диагностике ЧМЖЖ методом ИФА и Тавсияхо оид ба гузаронидани тадбирхои зиддиэпизооти ва пешгирикунанда хангоми тоуни чорвои хурди шохдор Рекомендации по проведению противоэпизоотических мероприятий при чуме мелких жвачных животных, утвержденные начальником и зам. Службы государственного ветеринарного надзора Министерства сельского хозяйства Республики Таджикистан марта г. Апробация работы. Основные положения диссертационной работы изложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета НЛП Биологические препараты Среднеазиатского ящурного института гг. Бишкеке и Москве. Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано научных работ, из них три статьи в изданиях, по перечню ВАК. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 9 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений и списка литературы. Список используемой литературы включает 1 источников, из которых иностранных. Диссертация иллюстрирована 9 рисунками, таблицами. Приложение на страницах. ИФА тестсистемы для выявления антител из сывороток крови больных и иммунизированных животных вирусом ЧМЖЖ.