Детекция бактерий рода Azospirillum с помощью бактериофагов, выделенных из Azospirillum brasilense штаммов Sp7 и SR75

• Автор: Караваева, Ольга Александровна
• Шифр специальности: 03.01.06, 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 173 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Бактериофаги почвенных микроорганизмов

Глава 2. Детекция микробных клеток с помощью бактериофагов и

фаговых миниантител

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 3. Объекты, материалы и методы исследований

3.1. Бактериальные штаммы и условия выращивания бактерий.

3.2. Выделение и характеристика бактериофагов

3.2.1. Определение концентрации фаговых частиц.
3.2.2. Определение морфологии негативных колоний.
3.2.3. Определение диапазона литической активности и специфичности действия выделенных бактериофагов
3.2.4. Определение устойчивости выделенных бактериофагов к воздействию высокой температуры
3.2.5. Определение устойчивости выделенных бактериофагов к воздействию хлороформа.
3.2.6. Определение устойчивости выделенных бактериофагов к воздействию разных значений .
3.2.7. Определение изменения активности бактериофагов при хранении.
3.2.8. Изучение морфологии фаговых частиц с помощью электронной микроскопии
3.3. Электрооптический анализ клеточных суспензий с применением выделенных бактериофагов.
3.3.1. Подготовка клеток к электрооптическому анализу
3.3.2. Проведение электрооптического анализа клеточных суспензий
3.4. Электроакустический анализ клеточных суспензий с использованием выделенных бактериофагов
3.4.1. Подготовка клеток к электроакустическому анализу.
3.4.2. Проведение электроакустического анализа микробных суспензий
3.5. Изучение взаимодействия миниантител с клетками бактерий
А. ЬгазПете Бр5
3.5.1. Аффинная селекция миниантител из фаговой библиотеки
3.5.2. Дотиммуноанализ.
3.5.3. Приготовление препарата по изучению взаимодействия клеток бактерий А. ЬгазПете Бр5 с полученными миниантителами с
помощью электронной микроскопии
Глава 4. Результаты исследований и их обсуждение
4.1. Выделение и характеристика бактериофагов, выделенных из Азр1гШит ЬгазПете штаммов 8р7 и 5
4.1.1. Выделение и характеристика бактериофага из АгозриШит ЬгазПете 8р7.
4.1.2. Выделение и характеристика бактериофага из АгозрЫИит
Ьгаз Пете 8Я.
4.2. Использование бактериофагов для детекции микробных клеток А2озр1гН1ит ЬгазПете с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий
4.2.1. Использование бактериофага, выделенного из А. ЬгазПете 8р7, для детекции клеток азоспирилл с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий.
4.2.2. Использование бактериофага, выделенного из клеток
А. ЬгазПете 8К., для детекции клеток с помощью электрооптического
анализа клеточных суспензий.
4.2.3. Определение литической активности бактериофагов с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий
4.3. Использование бактериофагов для детекции микробных клеток АгойртИит ЬгазПете с помощью метода электроакустического анализа микробных суспензий
4.3.1. Использование бактериофага из А. ЬгазПете 8р7 для
детекции клеток с помощью метода электроакустического анализа
4.3.2. Использование бактериофага из А. ЬгазПете БК для детекции клеток с помощью метода электроакустического анализа
4.4. Использование фаговых миниантител к поверхностным антигенам А. ЬгазПете 8р5 для детекции клеток с помощью методов электрооптического и электроакустического анализа микробных суспензий
4.4.1. Использование фаговых миниантител к поверхностным антигенам А. ЬгазПете Бр5 для детекции клеток с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий.
4.4.2. Использование миниантител к поверхностным антигенам А. ЬгазПете 8р5 для детекции клеток с помощью метода
электроакустического анализа микробных суспензий.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ


Классификация вирусов бактерий основывается на характеристике хозяина вируса, серологических, морфологических свойствах, строении и физикохимическом составе вириона Русалеев, . В настоящее время согласно Международной классификации и номенклатуре вирусов Vi x, бактериофаги, в зависимости от типа нуклеиновой кислоты разделяют на ДНК и РНК содержащие. По морфологическим характеристикам ДНКсодержащие бактериофаги выделены в следующие семейства vii, ivii, vii, iixvii, vii, ivii, vii, ivii, ivii, Ivii vi и vii Ivi. РНКсодержащие vii, vivii Ковалева, . Бактериофаги различаются по химической структуре, типу нуклеиновой кислоты, морфологии и характеру взаимодействия с бактериями. По размеру бактериальные вирусы составляют приблизительно от до 0 нм. Типичная фаговая частица вирион состоит из головки и хвостового отростка. В головке содержится генетический материал линейная двуцепочечная ДНК, реже ковапентно замкнутая кольцевая одноцепочечная ДНК, либо РНК Лысак, Золотухин, , окруженная белковой или липопротеиновой оболочкой каисидом Ковалева, . Бактериофаги по форме капсида могут быть экосаэдральные, сферические, кубические дли плеоморфные. Однако у немногих бактериофагов капсид имеет нитевидную форму. Хвостовой отросток представляет собой белковую трубку продолжение белковой оболочки головки. Существуют бактериофаги с сокращающимся, длинным не сокращающимся, коротким или не имеющие отростка , . Бактериофаги, как и все вирусы, являются абсолютными внутриклеточными паразитами Лабинская, . У них отсутствуют механизмы для выработки энергии и рибосомы для синтеза белка. Очень важным свойством бактериофагов является их специфичность бактериофаги лизируюг культуры определенного вида, т. Адамс, Гольдфарб, . По характеру взаимодействия бактериофага с бактериальной клеткой различают вирулентные и умеренные бактериофаги. Вирулентные бактериофаги могут только увеличиваться в количестве посредством литичсского цикла . Процесс взаимодействия вирулентного бактериофага с клеткой складывается из нескольких стадий адсорбции бактериофага на поверхности микробной клетки, проникновения, биосинтеза компонентов бактериофага и их сборки, лизиса клетки и выхода активных частиц бактериофага Лабинская, Гашошкин, , , i . Адсорбция заключается, очевидно, в образовании электростатических связей между различно заряженными аминогруппами отростка бактериофага и карбоксильными группами поверхности бактериальной клетки i, , . После чего, бактериофаги прикрепляются к фагоспецифическим рецепторам на поверхности клетки . ЛПС Т7, Р, белки поверхности Т1,Т5, . К, 1, НА . ДНК и белки бактериофага . Далее из фаговой нуклеиновой кислоты и белка формируются новые фаговые частицы, которые освобождаются из клетки после ее лизиса Тихоненко, Шлегель, , , . Количество фаговых частиц может колебаться от нескольких десятков до нескольких сотен. Период от момента инфицирования клетки бактериофагом до начала лизиса называется латентным и продолжительность его может составлять от нескольких минут до нескольких часов . У умеренных бактериофагов, напротив, после инфицирования клетки есть несколько способов репродукции. Иногда бактериофаг инициирует визирующий цикл, что приводит к лизису клетки и освобождению новых бактериофагов. В качестве альтернативы бактериофаг может инициировать лизогенный цикл, при котором он вместо репликации обратимо взаимодействует с генетической системой клеткихозяина , , , , , интегрируясь в хромосому или сохраняясь в виде плазмиды . Таким образом, вирусный геном реплицируется синхронно с ДНК клеткихозяина и делением клетки, а подобное состояние бактериофага называется профагом. Бактерия, содержащая профаг, становится лизогенной до тех пор, пока при определенных условиях или спонтанно профаг не будет стимулирован на осуществление лизирующего цикла репликации. Переход от лизогении к лизису называется лизогенной индукцией или индукцией профага . Профаги и фагоподобные частицы представляют собой наиболее важных посредников проявления разнообразия бактерий и бактериальной эволюции i, , .