Изучение микрофлоры рубца крупного рогатого скота на основе молекулярно-биологического метода T-RFLP с целью разработки способов ее оптимизации

• Автор: Ильина, Лариса Александровна
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 197 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Особенности пищеварения у жвачных животных
1.2. Экосистема рубца
1.2.1. Симбиоз между микроорганизмами рубца и животным
1.2.2. Условия, необходимые для роста и размножения микроорганизмов в рубце
1.2.3. Микроорганизмы рубца
1.2.4. Взаимодействие между микроорганизмами в рубце
1.3. Возможность управления процессами ферментации в рубце
1.4. Методы изучения микробиоценоза рубца жвачных животных
1.4.1. Традиционные микробиологические методы
1.4.2. Метагеномный анализ микробных сообществ
1.4.3. Проблемы получения качественной ДНК для метагеномных исследований
1.4.4. Молекулярно-генетические методы для изучения рубца жвачных
1.4.5. T-RFLP-анализ
1.5. Заключение по обзору литературы
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Методики проведения научно-хозяйственных экспериментов
2.1.1. Изучение суточной динамики микробного сообщества рубца бычков
2.1.2. Исследование возрастных изменений микробного сообщества рубца телят
2.1.3. Анализ микробиоценоза рубца коров в производственных условиях
2.2. Методики лабораторных исследований
2.2.1. Химический анализ кормов, кала и мочи

2.2.2. Химический анализ проб рубцового содержимого
2.3. Методы культивирования и количественного учета микроорганизмов
2.4. Молекулярно-генетические методы
2.4.1. Т-БТЕР-анализ
2.4.2. Секвенирование
2.5. Статистическая обработка материалов исследований
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Модификация Т-БР ЕР-анализа для изучения микробиоценоза рубца жвачных животных
3.1.1. Выбор метода выделения и очистки геномной ДНК
3.1.2. Подбор условий амплификации микроорганизмов рубца жвачных
3.1.3. Выбор эндонуклеаз рестрикции для Т-11РЪР-анализа
3.1.4. Анализ воспроизводимости методики Т-ВЕЕР
3.1.5. Анализ результатов Т-ВЕТР
3.1.6. Сравнительный анализ результатов исследования микробного сообщества рубца бычков с помощью традиционных методов микробиологии и Т-ББЕР
3.2. Результаты исследования динамики микробного сообщества рубца жвачных животных в течение суток и влияния на нее пробиотиков Ц,еллобактерин-Т и Целлобактерин
3.2.1. Интенсивность течения ферментативных процессов в рубце бычков
3.2.2. Результаты анализа суточной динамики микробиоценоза рубца бычков
3.3. Исследование возрастных изменений микробного сообщества рубца жвачных животных
3.4. Анализ микробиоценоза рубца коров в производственных условиях
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
БЭВ - безазотистые экстрактивные вещества;
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота; л - литр;
М - моль;
ME - массовые эксиваленты;
мг - миллиграм;
мин - минуты;
мкг - микрограм;
мкл - микролитр;
мл - миллилитр;
КАА - крахмало-аммииачный агар;
ЛЖК - летучие жирные кислоты;
МПА - мясопептонный агар;
иг - нанограмм;
об/мин - оборотов в минуту;
ПЦР - полимеразная цепная реакция;
ПЭГ - полиэтиленгликоль;
РНК - рибонуклеиновая кислота;
САМ - сусло-агар с мелом;
DGGE - денатурирующий градиентный гель-электрофорез;
FISH - флуоресцентная гибридизация «ш situ»;
T-RFLP (Terminal restriction fragment length polymorphism) - полиморфизм длин терминальных рестрикционных фрагментов;
TGGE - температурный градиентный гель-электрофорез.

ских бактерий (Martin, Nisbet, 1992; Wallace, Newbold, 1993), бактерий, утилизирующих лактат (Nisbet, Martin, 1990, 1991, 1993; Martin, Nisbet, 1992). Помимо этого, Доусон (Dawson, 1992) выделил штаммы дрожжей, которые стимулируют рост конкретных видов бактерий, в зависимости от решения необходимых задач, которые можно применять в различных условиях.
Повышение переваримости питательных веществ в рубце жвачных оказалось одний из самых сложных задач для исследователей. Несмотря на успешные достижения в области изменения концентраций отдельных ЛЖК в процессе ферментации кормов, улучшение усвояемости питательных веществ наблюдается в редких случаях. При этом наибольший эффект в этом направлении был установлен при использовании ферментных препаратов в рацонах жвачных. Так, включение экзогенной амилазы в рацион телят на откорме позволило увеличить потребление сухого вещества корма, и, соответственно, повысить продуктивность животных (Tricarico et al., 2007).
Несмотря на современные достижения, позволяющие воздействовать на ферментативные процессы в рубце, способствующие повышению продуктивности животных (Cotta, Russell, 1997; Weimer, 1998), необходимо более тщательное понимание взаимодействия между микроорганизмами в экосистеме рубца (Firkins, Hristov, 2006). Способность идентифицировать микроорганизмы, входящие в состав микробного сообщества дает возможность понимания механизмов взаимодействия микробов между собой, а также метаболических процессов, происходящих данных сообществах.
1.4. Методы изучения микробиоценоза рубца жвачных животных
1.4.1. Традиционные микробиологические методы
В настоящее время существует множество методов для изучения микроорганизмов рубца: выращивание их на искусственных питательных средах или выделение ДНК и дальнейшая их идентификация, т.е. минуя стадию