Биосинтез карбогидраз гриба Penicillium Verruculosum при культивировании на различных целлюлозосодержащих субстратах

• Автор: Немашкалов, Виталий Алексеевич
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 127 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

ГЛАВА 1. ЦЕЛЛЮЛОЗОСООДЕРЖАЩИЕ МАТЕРИАЛЫ (ЦСМ)

1Л. Виды и запасы ЦСМ

1.2. Состав и структура ЦСМ

1.3. Предварительная обработка ЦСМ

ГЛАВА 2. ФЕРМЕНТАТИВНОЕ РАЗРУШЕНИЕ ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАЩИХ МАТЕРИАЛОВ (ЦСМ)

2.1. Современные представления о классификации карбогидраз

2.2. Основные ферменты целлюлазного комплекса

2.3. Современные представления о механизме действия целлюлазного комплекса
2.4. Факторы, влияющие на эффективность ферментативного гидролиза целлюлозы
2.5. Штамм Pénicillium verruculosum и секрегируемые им ферменты
ГЛАВА 3. ОСНОВНЫЕ ПОДХОДЫ ДЛЯ УВЕЛИЧЕНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ ШТАММОВ МИКРООРГАНИЗМОВ
3.1. Влияние условий ферментации на эффективность биосинтеза ферментов грибными продуцентами
3.2. Получение генетически измененных штаммов P. verruculosum
3.2.1. Ненаправленный мутагенез
3.2.2. Генетическая инженерия
ГЛАВА 4. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КАРБОГИДРАЗ В РАЗЛИЧНЫХ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССАХ
4.1. Использование ферментов в качестве кормовых добавок
4.2. Использование ферментов для отбеливания целлюлознобумажной пульпы
4.3. Применение ферментов в текстильной промышленности
4.3.1. Биоотварка хлопчатобумажных тканей
4.3.2 Биодепигментация и биополировка хлопчатобумажных изделий
4.4. Применение ферментов в производстве альтернативного топлива
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 5. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ
5.1. Исходный штамм-продуцент
5.2. Использованные вещества

5.2.1. Ферментные препараты
5.2.2. Субстраты и реактивы
5.2.3. Состав питательных сред
5.3. Методы
5.3.1. Мутагенез и селекция штаммов
5.3.2. Метод получения протопластов
5.3.3. CaCh/PEG трансформационный метод
5.3.4. Культивирование гриба P. verruculosum в колбах
5.3.5. Культивирование гриба P. verruculosum в ферментерах
5.3.6. Метод определения сахаров
5.3.7. Метод определения концентрации белка
5.3.8. Методы определения активности ферментов
5.3.9. Определение гидролитической способности ферментных препаратов
5.3.10. Оценка “кормовой” эффективности ферментов
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
ГЛАВА 6. ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ - ПРОДУЦЕНТОВ ЦЕЛЕВЫХ ФЕРМЕНТОВ
6.1. Получение маркерного штамма-реципиента для последующей трансформации целевыми генами р-глюкозидазы (PGlu) и эндоглюканазы (EGII)
6.1.1. Получение споровой суспензии штамма гриба P. verruculosum В221-151 и подготовка к УФ - мутагенезу
6.1.2. Проведение УФ - мутагенеза
6.1.3. Отбор мутантов на селективной среде с хлоратом натрия
6.1.4. Скрининг устойчивых к хлорату натрия niaDн мутантов среди колоний штамма Pénicillium verruculosum В221-151, тестирование их по способности усваивать различные источники азота
6.1.5. Отбор истинных niaD'мутантов
6.2. Трансформация штамма-реципиента P. verruculosum В
6.2.1. Первичный скрининги анализ трансформантов, содержащих
гомологичный ген эндоглюканазы II P. verruculosum
ГЛАВА 7. ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ-ПРОДУЦЕНТОВ Р-ГЛЮКОЗИДАЗЫ И
ЭНДОГЛЮКАНАЗЫ II В 1 -ЛИТРОВОМ ФЕРМЕНТЕРЕ
7.1. Культивирование рекомбинантных штаммов-продуцентов ЭГП в 1-литровых ферментерах

7.1.1. Оптимизация процесса подачи подпитывающего раствора при культивировании штамма Р. уеггисиЬьит ЭГП
7.1.2. Влияние температуры и pH ферментационной среды на биосинтез ферментов штаммом Р. еггиси1о$ит ЭГП
7.1.3. Оптимизация состава питательной среды при культивировании штамма
Р. erruculosum ЭГП
7.2. Культивирование рекомбинантных штаммов-продуцентов (3-глюкозидазы в
1-литровых ферментерах
7.2.1. Оптимизация процесса подачи подпитывающего раствора при культивировании штамма Р. уеггиси1о5ит ПО
7.2.2. Влияние температуры и pH ферментационной среды на биосинтез ферментов штаммом Р. уеп-исиЬяитЮ
7.2.3. Оптимизация состава питательной среды при культивировании штамма
Р. уеггиси1о$ит¥
7.3. Совместное культивирование рекомбинантных штаммов Р. уеггиси1озит
ЭГП-40 и ПО с исходным штаммом Р. erruculosum В537
7.3.1. Совместное культивирование штаммов Р. errnculosum В537 и НО
7.3.2. Совместное культивирование штамма Р. ierruculosum В537 и ЭГ И
ГЛАВА 8. ИНДУКЦИЯ ЦЕЛЛЮЛАЗ ШТАММА Р. УЕкКиСИПЖМ ЭГП-40 РАЗЛИЧНЫМИ ДИСАХАРИДАМИ
8.1. Получение смеси продуктов реакции поликонденсации с помощью ферментных препаратов Р. еггжи1озит В537 и НО
8.2. Полная или частичная замена МКЦ на смесь сахаров при культивировании штамма Р. verruculosum ЭГП-40 в колбах
8.3. Исследование влияния различных дисахаридов на биосинтез целлюлаз штаммом
Р. уеггиси1озат ЭГП-40 при культивирования в колбах
8.4. Полная или частичная замена МКЦ на смесь сахаров при культивировании
штамма Р. уеггиси1о$ит ЭГП-40 в 1-литровых ферментерах
ГЛАВА 9. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ТРАНСФОРМАНТА Р. УЕККиСЛЛ.ОЕНМЭГП
НА РАЗЛИЧНЫХ ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАЩИХ СУБСТРАТАХ
9.1. Исследование возможности полной замены МКЦ на альтернативные целлюлозосодержащие субстраты при культивировании рекомбинантного штамма ЭГП

Очевидно, что такие условия приводят к повышенному износу оборудования, а также неблагоприятны для окружающей среды. По сравнению с традиционным химическим способом обработки ферменты обеспечивают более щадящие условия проведения процесса, поскольку обработка ткани ведется, как правило, при 30-70 С и значениях pH близких к нейтральным [195,196].
Авторами [196] было показано, что значительного увеличения гидрофильности можно добиться при использовании комплексных ферментных препаратов, обладающих и целлюлазной, и пектиназной активностью, причем среди ферментных комплексов продуцентов Aspergillus japonicus, A. foetidus, A. heteromorphus, T. Reesei и Pénicillium verruculosum наиболее эффективны для биоотварки. Препараты протеаз, липаз и пектиназ, не обладающие целлюлазной активностью, малоэффективны.
4.3.2. Биодепигментация и биополировка хлопчатобумажных изделий.
Открытие у целлюлаз тополитических свойств [111], а именно способности к мягкому воздействию на поверхность целлюлозных волокон без их существенной деструкции, привело к появлению новых направлений использования целлюлаз. Это биополировка текстильных изделий, приводящая к удалению ворса и умягчению их поверхности, а также биодепигментация хлопчатобумажных и льняных материалов, сопровождаемая изменением их цветности. В обоих случаях удается достичь высоких потребительских характеристик текстильных изделий, которых невозможно достичь другим способом [197,198].
В настоящее время не существует общепринятой теории, объясняющей тополитическую активность некоторых целлюлаз. Проведенные исследования в данной области позволяют предположить, что тополитическое ферментативное воздействие, вызванное особой специфичностью ß-гликаназ, осуществляется, по-видимому посредством ферментов эндодеполимеразного типа. Прямой корреляции между тополитическими свойствами и какой-либо из специфических активностей ферментных препаратов выявлено не было [199].
Основным требованием, предъявляемым к ферментам, осуществляющим биополировку и биодепигментацию, является сохранение прочности обрабатываемых целлюлозных волокон. Следует отметить, что прочность целлюлозных волокон и потеря веса ткани после ферментативной обработки не коррелируют между собой [200,201]. Так, например, обработка хлопковой ткани эндоглюканазой I Т. reesei приводит к большей потере веса, но меньшей пиллингуемости (на англ. “pilling” - скатывание волокон в