Изучение функциональных активностей инсуляторов из регуляторных областей генов yellow и white у D. melanogaster

• Автор: Ерохин, Максим Максимович
• Шифр специальности: 03.00.26
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 136 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Цель и задачи исследования

Научная новизна и практическая ценность работы

Апробация работы

Публикации

Благодарности

ГЛАВА I. Роль инсулмторов в регуляции транскрипции генов, транскрибируемых РНКполимеразой у . ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ

1. Регуляторные элементы ДНК и РНКполимеразаПзависимая

транскрипция

1.1. Промотор

1.2. Активация и репрессия транскрипции
1.2.1 Энхансеры
1.2.2. элементы и сайлснсинг
1.3. Инсуляторы
2. Характеристика инсуляторов i
2.1. Инсуля горы генов теплового шока и
2.2. 8иНшсодержащие инсуляторы
2.2.1. 8иНуинсулятор
2.2.2.1 А2инсулятор
2.2.3. Другие 8иНусвязывающие инсуляторы
2.3. Инсуляторы регуляторной области гена
2.3.1. 7 i7
2.3.2. МСР
2.3.3. 8

2.4. Инсулятор i
2.5. Другие инсуляторы i
3. Модели эихансерблокирующсй активности инсуляторов
3.1. Структурные модели
3.2. Транскрипционные модели
3.3. Нейтрализация энхансерблокирующей активности инсуляторов
ГЛАВА И. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Генетические методы
1.1.1. Линии i , использованные в данной работе
1.2. Трансформация эмбрионов i и получениетрансгенных линий
1.3. Фенотипический анализ экспрессии генов и iii в трансгенных линиях
1.4. Генстическис скрещивания
2. Биохимические методы
2.1. Работа с бактериальной линией .i I I5
2.1.1. Среды для культивирования
2.1.2. Приготовление компетентных клеток линии .i
2.1.3. Трансформация плазмидной ДНК в бактерии линии .i 5
2.2. Методы рабо ты с ДНК
2.2.1. Рестрикция ДНК, тупление липких концов,
дефосфорилирование и лигирование фрагментов ДНК
2.2.2. Определение концентрации ДНК
2.2.3. Спиртовое осаждение ДНК
2.2.4. Горизонтальный электрофорез в агарозном геле
2.2.5. Выделение фрагментов ДНК из геля
2.2.6. Выделение ДНК плазмид методом щелочного лизиса из бактериальных клеток линии .i 5
2.2.6.1 .Минипрепаративпос выделение плазмидной ДНК
2.2.6.2.Максипрепаративное выделение плазмидной ДНК
2.2.7. Выделение геномной ДНК из мух с использованием
2.3. Саузернблотанализ
2.4. Метод полимеразной цепной реакции ПЦР
2.4.1. ПЦР с использованием Д1 ПСполимеразы
2.4.2. ПЦР с колоний .i 5, несущих плазмиду, с использованием ДНКполимеразы
2.4.3. ПЦР с использованием i ДНКполимеразы
2.4.4. ПЦР с использованием I ДНКполимеразы
2.5. Трансфекция клеток 2 i и анализ активности
люцифераз
2.6. Анализ активности гена галактозидазы в мухах
Создание трансгенных конструкций
3.1. Конструкции для тестирования инсулятора i на сайленсер
блокирующую активность
3.2. Конструкции для тестирования взаимодействий инсуляторов и промоторов
3.3. Получение конструкций для изучения инсуляторов на клеточных
линиях дрозофила
Иммунопреципитация хроматина
4.1. Иммунопреципитация хроматина, выделенного из клеточной культуры дрозофила 2
4.2. Иммунопреципитация хроматина на разных стадиях развития дрозофила
4.3. Праймеры, использованные для анализа материала методом ПЦР в реальном времени, полученного при иммунопреципитации хроматина
ГЛАВА III. Результаты исследования
1. Изучение сайленсерблокирующей активности iинсулятора .

1.1. iинсулятор обладает сайленсерблокирующей активностью
1.2. Фрагмент iинсулятора длиной 8 п.н. достаточен для энхансерблокирующей и сайленсерблокирующей активностей инсулятора
1.3. Инсуляторньте белки Еу2 и СР0 взаимодействуют с iинсулятором i viv
1.4. Снижение уровня экспрессии гена еу2 влияет на блокирующую, но не на энхансерблокирующую активность iинсулятора i viv
2. Изучение взаимодействия между инсуляторами и промоторами у .

2.1. i и 1 А2инсуляторы функционально взаимодействуют с промоторами генов i и , соответственно
2.2. 1А2инсулятор способен взаимодействовать с двумя промоторами в одной системе
2.3. Четырех сайтов связывания для белка достаточно для обеспечения активации промотора гена 4активатором
2.4. Белок СР0 присутствует на минимальном промоторе гена теплового шока при взаимодействии промотора с 1А
инсулятором
3. Создание новой системы те1апоаег ГЛАВА IV. Обсуждения Заключение ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


X i v x последовательности, являющиеся сайтами для сайтспецифической рекомбиназы Сге. Сге. I i сайтспецифическая рекомбиназа . Транскрипция является ключевым этапом, на котором контролируется уровень экспрессии генов. Инициация и регуляция транскрипции ДНК у высших эукариот с участием РНКполимсразы II зависит от множества факторов от цисдействующих регуляторных ДНКпоследовательностей итрансдействующих белков. Цисдействующие регуляторные ДНКпоследовательности включают энхансеры, сайленсеры, базальный промотор, инсуляторы. Энхансеры ДНКпоследовательности, представляющие собой сайты связывания белковактиваторов транскрипции. Энхансеры высших эукариот могут располагаться на разном расстоянии от промотора контролируемого ими гена. Так, некоторые энхансеры способны активировать гены на больших расстояниях, достигающих нескольких десятков тысяч мар нуклеотидов. Энхансеры действуют вне зависимости от положения относительно направления транскрипции гена. Сайленсеры элементы, оказывающие негативное влияние на транскрипцию генов на них собираются белковые комплексы, подавляющие экспрессию генов. К сайленсерам относятся ДНКэлемснты для сборки комплекса белков группы . Так же как и энхансеры, сайленсеры действуют вне зависимости от их положения относительно направления транскрипции гена и не обладают специфичностью действия. Предполагается, что важная роль в контроле специфичности действия энхансеров и сайленсеров принадлежит инсуляторам. В настоящее время сформулированы два независимых критерия, по которым регуляторпыйэлемент может быть отнесен к инсуляторам способность блокировать энхансеры и служить барьером между транскрипционно активным хроматином и гетерохроматином. Инсуляторы блокируют активность энхансера, по это происходит только в том случае, если инсулятор находится между энхансером и промотором гена. Для некоторых инсуляторов показана способность блокировать репрессию, опосредованную сайленсерами. В настоящее время существует две группы моделей функционирования инсуляторов. Модели первой группы предполагают физическое прикрепление белков, взаимодействующих с ДНКпоследовательностыо. Модели второй группы постулируют, что инсуляторы блокируют передачу прием сигнала от энхансера к промотору. Предполагается существование нестабильных взаимодействий между белками, взаимодействующими с инсуляторами и белками других регуляторных элементов энхансеров или промоторов. Несмотря на большое количество накопленной информации, ни одна из. Становится очевидным, что как дальнейшее изучение многообразия инсуляторов, так и изучение их функциональных свойств необходимо для понимания механизма их действия и роли в регуляции транскрипции. Данная работа посвящена изучению свойств i и 1 А2инсуляторов . В геноме iинсулятор находится между расположенными друг за другом генами i и 5, в непосредственной близости от Зконца гена i. А2инсулятор был обнаружен между геном и генным комплексом, внепосредственной близости от Зконца гена . В данной работе показано, что iинсулятор обладает сайленссрблокирующей активностью. Разработана новая модельная система для тестирования ДНКпоследовательностей на инсуляторную активность. Основной цслыо работы явилось изучение свойств i и 1А2инсуляторов. Выяснить способность iинсулятора блокировать сайленсер из регуляторной области гена x. Определить входят ли инсуляторные белки СР0 и Еу2 в состав белкового комплекса iинсулятора. Выяснить возможность взаимодействия i и 1А2инсуляторов с промоторами генов i и , соответственно. Разработать модельную систему для тестирования ДНКпоследовательностей. В работе впервые показано наличие у iинсулятора сайленсерблокирующей активности. Показано, что инсуляторные белки СР0 и Еу2 являются белковыми компонентами iинсулятора. Продемонстрировано прямое участие Еу2 в сайленсерблокирующей, но не в энхансерблокирующей активности iинсулятора. В данной работе показано, что инсуляторы i и 1А2 взаимодействуют с промоторами генов i и у соответственно. Разработана новая модельная система для быстрого анализа ДНКпоследовательностей на наличие инсуляторной активности.