Механизм действия Su(Hw) инсулятора Drosophila melanogaster

• Автор: Савицкая, Екатерина Евгеньевна
• Шифр специальности: 03.00.26
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 87 с.

1.ВВЕДЕНИЕ

2.0БЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Инсуляторы новые регуляторные элементы высших эукариот

2.1. Определение и общие свойства инсуляторов.

2.2. Структура и функции инсуляторов

2.2.1 . инсулятор

2.2.2. Инсуляторы локуса теплового шока и .

2.2.3. Инсуляторы регуляторной области гена

2.2.4. Куриный глобиновый инсулятор

2.3. Модели действия инсуляторов.

2.3.1. Структурные модели

2.3.2. Транскрипционные модели.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Генетические методы.
3.1.1. Линии и мутации i , использованные в данной работе
3.1.2. Трансформация эмбрионов i и получение трансгенных линий
3.1.3. Фенотипический анализ экспрессии генов и iii в трасгенных линиях.
3.1.4.Генетические скрещивания.
3.2. Биохимические методы
3.2.1. Выделение ДНК из дрозофилы
3.2.2. Саузернблот анализ.
3.2.3. Метод полимеразной цепной реакции ПЦР
3.2.4. Секвенирование плазмид и ПЦР продуктов.
3.2.5. Молекулярное клонирование
3.2.6. Трансформация бактериальных клеток плазмидами
3.2.7. Выделение ДНК плазмид методом щелочного лизиса.
3.2.8. Создание конструкций.
4. РЕЗУЛЬТАТЫ.
4.1. Создание модельной системы для изучения свойств инсулятора
4.2. Два инсулятора, фланкирующие либо энхансеры, либо промотор гена , сохраняют способность блокировать энхансерпромоторные взаимодействия
4.3. Два инсулятора, расположенные между энхансерами и промотором гена , не способны блокировать взаимодействия между энхансером и промотором
4.4. Два инсулятора, расположенные между энхансерами и промотором гена iii, не только не препятствуют, но и способствуют энхансерпромоторным взаимодействиям.
4.5. Исследование роли мутации 4, в экспрессии гена iii в линиях
4.6. Исследование роли белкового продукта гена в экспрессии гена iii в линиях .
4.7. Роль положения инсуляторов и расстояния между ними в эффекте нейтрализации инсуляции.
4.8. Три Ii инсулятора, расположенные между энхансером и промотором, нейтрализуют действие друг друга
5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
5.1. В основе явлений инсуляции и нейтрализации инсуляции лежит взаимодействие
между инсуляторами.
5.2. Анализ существующих моделей действия инсуляторов с точки зрения полученных результатов.
5.3. Возможная роль ВТВ доменов в инсуляции и в образовании взаимодействий между энхансером и промотором.
5.4. Роль белка во взаимодействии между энхансером и промотором гена iii.
5.5. Новая модель явления инсуляции.
6.ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Инсуляторы локуса теплового шока и . Модели действия инсуляторов. Транскрипционные модели. Генетические методы. Фенотипический анализ экспрессии генов и iii в трасгенных линиях. Генетические скрещивания. Саузернблот анализ. Секвенирование плазмид и ПЦР продуктов. Выделение ДНК плазмид методом щелочного лизиса. Создание конструкций. РЕЗУЛЬТАТЫ. Два инсулятора, расположенные между энхансерами и промотором гена iii, не только не препятствуют, но и способствуют энхансерпромоторным взаимодействиям. Исследование роли белкового продукта гена в экспрессии гена iii в линиях . Роль положения инсуляторов и расстояния между ними в эффекте нейтрализации инсуляции. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ. Анализ существующих моделей действия инсуляторов с точки зрения полученных результатов. Возможная роль ВТВ доменов в инсуляции и в образовании взаимодействий между энхансером и промотором. Роль белка во взаимодействии между энхансером и промотором гена iii. Новая модель явления инсуляции. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. Геном высших эукариот содержит огромное количество генов и элементов их регуляции, таких как энхансеры и сайленсеры. Принято считать, что энхансеры способны определять временную и пространственную экспрессию генов, взаимодействуя непосредственно с белками транскрипционного комплекса, которые собираются на промоторе. Энхансеры могут активировать транскрипцию гена независимо от ориентации и находясь от промотора на расстоянии, которое может достигать нескольких сотен тысяч пар нуклеотидов БогееИ . Многие энхансеры не имеют специфичности к определенному промотору и способны активировать транскрипцию с целого ряда генов. Так как в геноме гены располагаются часто достаточно близко друг к другу, возникает вопрос, каким образом энхансер взаимодействует с промотором своего гена и как предотвращается активация нежелательных промоторов, которые могут находится в непосредственной близости от энхансера. Около десяти лет назад был открыт новый тип регуляторных элементов, названных инсуляторами. Инсуляторы это регуляторные элементы, которые способны блокировать взаимодействия между энхансером и промотором гена только в том случае, если находятся между ними. Выяснение механизмов действия инсуляторов представляет большой интерес, так как позволяет приблизиться к пониманию проблемы взаимодействия между энхансером и промотором в ганоме. Кроме того, изучение действия инсуляторов является важной прикладной задачей для создания векторов, которые способны поддерживать стабильную экспрессию генов вне зависимости от места интеграции в генОхМе. Было предложено несколько моделей механизма действия инсуляторов. Однако ни одна из них не объясняет всех известных экспериментальных данных. Следует отметить, что за последние два года были найдены случаи, в которых инсуляторы оказываются неспособными блокировать действие згхансеров на промотор vi . Для объяснения таких результатов было предложено существование факторов, которые способны модулировать инсуляторную активность или даже нейтрализовать ее. Выяснение причин нейтрализации действия инсуляторов и выявление модулирующих факторов является одним из ключей ведущих к решению проблемы механизмов действия инсуляторов, а, следовательно, механизму специфичного взаимодействия между энхансером и промотором на больших дистанциях. Недавно в нашей лаборатории на примере генетической системы гена и его супернестабильных мутаций, полученных при перемещении мобильных элементов, был описан случай отсутствия инсуляторной активности при расположении энхансеров между двумя инсуляторами . Генетические системы являются очень удобными объектами для изучения дальних взаимодействий между регуляторными элементами, однако, их недостатком является сложность и многокомпонснтность, затрудняющие интерпретацию полученных результатов. Поэтому, задачей данной работы являлось исследование способности инсуляторов блокировать взаимодействие между энхансером и промотором в зависимости от числа и расположения инсуляторов на модельной системе с помощью трансгенных конструкций.