Функциональное исследование регуляторного элемента Frontabdominal-7 гена Abdominal-B у Drosophila melanogaster

• Автор: Родин, Сергей Алексеевич
• Шифр специальности: 03.00.26
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 92 с. : ил.

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1 Общие вопросы регуляции экспрессии генов эукариот.

1.2 Определение и общие свойства инсуляторов.

1.3 Структура и функции инсуляторов.

1.3.1 Инсулятор .

1.3.2 Инсуляторы локуса теплового шока и

1.3.3 Инсуляторы регуляторной области гена .

1.3.4 Инсулятор 7.

1.3.5 Куриный глобиновый инсулятор.

1.4 Модели действия инсуляторов.

1.4.1 Структурные модели.
1.4.2 Транскрипционные модели.
2. Материалы и методы.
2.1 Генетические методы.
2.1.1 Линии и мутации i , использованные при генетических скрещиваниях в работе.
2.1.2 Трансформация эмбрионов i и получение трансгенных линий.
2.1.3 Фенотипический анализ экспрессии генов и iii в трансгенных линиях.
2.1.4 Генетические скрещивания.
2.2. Биохимические методы.
2.2.1. Выделение ДНК из дрозофилы.
2.2.2. Саузернблотанализ.
2.2.3. Метод полимеразной цепной реакции ПЦР.
2.2.4. Ссквенирование плазмид и ПЦР продуктов.
2.2.5. Молекулярное клонирование.
2.2.6. Трансформация бактериальных клеток плазмидами.
2.2.7. Выделение ДНК плазмид методом щелочного лизиса.
2.2.8. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля.
2.2.9. Создание конструкций.
3. Результаты.
Л ого
3.1 Фрагмент 7 , в отличие от фрагмента 7 , обладает свойствами .
3.2 Создание нового метода делеции заданной последовательности в трансгенных линиях i .
3.3. Фрагменты 3 блокируют взаимодействие между энхансером и промотором и функционально взаимодействуют между собой.
3.4. Элементы не влияют на функциональное взаимодействие инсуляторов 7.
3.5. Фрагменты блокируют взаимодействие между энхансером и промотором, функционально взаимодействуют между собой, не обладают полярностью и их инсуляторные свойства зависят от положения в конструкции.
3.6. Фрагмент способен защитить промотор от негативного действия .
3.7. Идентификация минимального элемента в 7 инсуляторе, который блокирует активность .
4. Обсуждение.
4.1. Новая система делеции заданной последовательности в трансгенных линиях i . Перспективы применения для решения различных задач современной биологии.
4.2. Новые свойства и возможный механизм действия регуляторных элементов гена .
Выводы.
Список литературы


Эта гипотеза предсказала существование граничных элементов, которые не позволяют энхансерам активировать чужие промоторы. Такие элементы были найдены и получили название инсуляторы. Примером таких инсуляторов является . В то же время не все подобные регуляторные элементы обладают столь очевидными свойствами. Гомеозисный ген участвует в образовании парасегментов дрозофилы i . Его регуляторная область размером примерно т. Предполагается, что инсуляторы окружают каждый энхансер и образуют ряд независимых регуляторных доменов. Например, один из таких доменов окружен инсуляторами 7 и 8. Исходя из определения инсулятора, трудно объяснить каким образом энхансер, окруженный двумя инсуляторами, может активировать транскрипцию гена . Следовательно, элемент 7, хоть и проявляет инсуляторные свойства в экспериментах на трансгенах . Целью настоящей работы было изучение необычных свойств и структуры регуляторного элемента 7. Используя молекулярный анализ мутаций этого элемента и поиск сайтов связывания известных белков с его последовательностью, мы предположили структуру элемента 7 и, используя трансгенных мух, изучили их функции. Одной из самых больших проблем при исследованиях на трансгенах является эффект положения. Эффект положения генетической конструкции в геноме приводит к тому, что экспрессия генов одной и той же генетической конструкции может существенно различаться у разных трансгенных линий. Причиной этого служит влияние регуляторных элементов, окружающих точку встраивания конструкции в геном. Следовательно, при исследовании, например, взаимодействия между регуляторными элементами необходимо иметь возможность удалять каждый из этих элементов из генетических конструкций. Для этого используют Сгеx и рекомбиназные системы, которые позволяют удалять части конструкций из генома трансгенных мух. Однако, для проведения многих современных исследований, двух этих систем недостаточно. Например, для исследования взаимодействий между инсуляторами, требуется вырезать все инсуляторы не менее двух и энхансеры маркерных генов конструкции. Следовательно, создание новых систем для iviv редактирования последовательностей генетических конструкций позволит облегчить исследования сложных регуляторных систем, например инсуляторов регуляторной области тъшАЬ1В. Нами была создана новая система на основе эндонуклеазы I, которая, наряду с ранее описанными Ix и системами, может быть использована для вырезания части конструкции из трансгенных мух. Наши результаты свидетельствуют о том, что и другие редкощепящие эндонуклеазы также могут быть использованы для этой цели, что открывает возможность создания множества подобных систем. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Общие вопросы регуляции экспрессии генов эукариот. Взаимосвязь между организацией хроматина внутри ядра и регуляцией генной экспрессии является одним из важнейших и интереснейших вопросов современной биологии. Хроматин внутри ядра эукариотической клетки организован в функциональные домены, содержащие индивидуальные или группы генов i ii . Гены внутри функционального домена имеют определенный во времени и процессе развития и независимый от окружающих последовательностей уровень экспрессии. Основными регуляторами активности гена являются энхансеры и сайленсеры, которые могут располагаться на больших расстояниях от регулируемого ими гена. Энхансерами принято называть последовательности ДНК, которые способны активировать транскрипцию независимо от ориентации и расстояния до точки начала транскрипции. Обнаружение этого класса регуляторных элементов поставило вопрос о том, каким образом клетка раничивает действие этих регуляторных элементов только определенным набором промоторов, специфическим для различных тканей и периодов жизненного цикла клетки. Как показали эксперименты на трансгенных организмах и линиях трансгенных клеток далее трансгенах, лишь небольшая часть энхансеров имеет специфичность к определенным промоторам , , тогда как большинство из них могут активировать экспрессию широкого спектра генов. Было предположено, что геном эукариотической клетки организован в функциональные домены.