Стратегия идентификации генетических локусов при гетерогенных менделирующих наследственных заболеваниях

• Автор: Поляков, Александр Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.26
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 236 с. : ил

ВВЕДЕНИЕ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Генетическое картирование наследственных заболеваний.

1.1 Стратегия позиционного клонирования

1.2. Методы генетического картирования.

1.3. Проблема идентификации локуса заболевания для семей ограниченного размера.

I.4 Разработка алгоритма идентификации патологического гена при генетически гетерогенных менделирующих заболеваниях.
II. Установление генетической природы заболевания при нейросенсорпой тугоухости на основе анализа частых мутаций в локусе 1РВ1.

.1 Общая характеристика ИСТ

.2 Локус несиндромальной ту ту хости ГГЫВ 1 и мутации в нем

.3 Анализ частых мутации в локусе СТИВ 1.
II.4. Обсуждение результатов
III. Установление генетической природы заболевания при атипичных спинальных амиотрофиях на основе анализа частой мутации в гене 8ММ.
III.1. Общая характеристика спинальных амиотрофий
1.2. Генетическая природа САМ
1.3. Поиск мутаций и анализ сцепления с геном при атипичных САМ II 1.4. Обсуждение результатов
IV. Анализ геновкандидатов для установления локуса заболевании при зонулярной катаракте.
IV. 1. Общая характеристика наследственных катаракт
IV.2. Гены, ответственные за возникновение катаракт и мутации в них
IV.3. Анализ сцепления с кандидатными локуса.мн и поиск мутации,
приводящей к заболеванию, в семье с порошкообразной зонулярной катарактой
1У.4. Обсуждение результатов
V. Анализ геновкандидатов для определения локуса заболевания и мутаций в семье с аутосомнорецессивной пигментной дегенерацией сетчатки.
V Общая характеристика НДС
V.2. Структура, функции и мутации гена
V.3. Описание клинического фенотипа и родословной семьи с ПДС
V.4. Анализ сцепления с кандидатными локусами в семье с ПДС
V.5. Поиск мутаций в гене
V.6. Обсуждение полученных результатов.
VI. Анализ сцепления с функциональными генамнкандидатами и использование метода полногеномного скрининга для определения локуса заболевания в семьях с наследственной моторносенсорной нейропатией.
VI. 1. Общая характеристика НМСН
VI.2. Клиническая систематика НМСI
VI.3. Молекулярногенетическая характеристика IIII
VI.4. Гены, ответственные за НМСН, и их функции
VI.5. Описание фенотипа и анализ родословных семей с НМСП II
VI.6. Диализ генетического сцепления заболевания с известными
локусами НМСН в семьях.
VI.7. Анализ генетического сцепления с другими генамикандидатами
аксональной формы моторносенсорных нейропатий в семье с НМСН 2Е. 7 VI.8. Поиск мутаций, приводящих к заболеванию, в генах и 0 VI.9. Полногеномный скрининг в семье с НМСН 2.
VI. . Определение минимальной области локализации гена заболевания
в семье с НМСН 2.
VI. . Обсуждение результатов.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Ix в течение минут, промывали водой, и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете при длине волны 2 нм. М трисацетат, 2. ЭДТА, и содержащем 0. Результаты фиксировали, фотографируя гель в проходящем ультрафиолетовом свете. Для повышения эффективности поиска мутаций методом анализа в длинных ПЦРфрагментах экзонов, для анализа делеций в 7, 8 экзонах гена , для подтверждения изменения нуклеотидной последовательности, определенного методом прямого автоматического секвенирования и для проверки сегрегации с заболеванием обнаруженной мутации в исследуемой семье, а также для скрининга на данную мутацию ДНК здоровых лиц использовались эндонуклеазы рестрикции. В работе использованы эндонуклеазы производства НПО , фирм и , реакцию проводили согласно протоколу фирмыпроизводителя. Поиск мутаций в кодирующих областях исследуемых генов проводился методом анализа i i , i . Перед проведением анализа продукты ПЦР размером более 0 н. С целью повышения эффективности выявления мутаций, анализ одних и тех же фрагментов проводили параллельно, используя разные модификации этого метода 1 применяли температурную или щелочную денатурации 2 проводили электрофорез в ПААГ как в присутствии 5 глицерина, так и без глицерина 3 проводили электрофорез в ПААГ как при комнатной температуре, так и при температуре 4С. ПЦР мкл амплификата смешивали с 5 мкл 0. М и и 0. II1 ААбисАА 1, приготовленный на 0. ПЦР 5 мкл амплификата смешивали е мкл формамидного буфера формамид мМ ЭДТА, 8. Для последующего элюирования фрагмента одноцепочечной ДИК с измененной электрофоретической подвижностью, проводили с щелочной денатурацией, после чего окрашивали гель раствором бромистого этидия 0. Определение нуклеотидной последовательности. Определение нуклеотидной последовательности образцов, в которых были выявлены изменения при анализе, проводилось методом прямого автоматического секвснироваиия продукта ПЦР как с прямого, так и с обратного праймера, на основе ферментативного сиквенса по методу Сэигера . В лаборатории ДНКдиагностики МГНЦ РАМН секвенирование проводили согласно протоколу секвснироваиия
i фирмы на автоматическом секвенаторе фирмы . Перед проведением реакции секвеиирования продукт ПЦР очищали с помощью электрофореза в 1 геле, приготовленном из легкоплавкой агарозы на 1х буфере ГАЕ. Фрагмент ДНК для секвснироваиия выделяли из геля, используя набор i iii . В. с II был проведен на базе лаборатории молекулярной генетики Университета г. Антверпена Бельгия. Среднее расстоянием между маркерами составляло . М Генотипирование проводили на автоматическом секвенаторе I 7, для первичной обработки данных использовали программы I версия 2. Оценку сцепления локуса заболевания с геномными маркерами проводили на основании статистического анализа сегрегации заболевания в семье с аллелями полиморфных маркеров, используя метод максимального правдоподобия , . Двухлокусный анализ сцепления осуществлялся с помощью программы I, входящей в пакет программ I, версия 5. Для мультилокусного анализа сцепления использовалась программа I. I, версия 4. Р. Спинальную амиотрофию и пигментную дегенерацию сетчатки рассматривали как аутосомнорецессивные заболевания, а наследственную моторносенсорную нейропатию и порошкообразную зонулярную катаракт как аутосомнодоминантные. Для всех заболеваний пенетрантность принимали равной 0. Частота заболеваний была задана равной 0 Частоты аллелей полиморфных маркеров были заданы в соответствии с частотами, представленными в базе данных v. Если информация о частоте аллелей маркера отсутствовала в базе данных, то она оценивалась приблизительно, исходя из частоты встречаемости аллелей в хромосомах неродственного происхождения в анализируемой семье. Значение 0, которому соответствовало максимальное значение балла. За область исключения принималась область, прилежащая к данному геномному маркеру, внутри которой значение балла было меньше или равно 2. Значение час готы рекомбинации 0. Размер области исключения рассчитывался из величины 0. I . Ь . I . ДНК генов и полиморфных маркеров vv и v . Vi.