Механизмы возникновения химерных элементов и их использование для изучения взаимодействия между регуляторными элементами на больших дистанциях у Drosophila melanogaster

• Автор: Головнин, Антон Клеменсович
• Шифр специальности: 03.00.26
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 118 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ .

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 .Инсуляторы

1.1.1.Структура и свойства инсуляторов

1.1.2. Модели механизмов действия инсуляторов

1.2. Характеристика Р элемента

1.2.1. РМ гибридный дна енсз, индукция транспозиций Р элемента

1.2.2. Места инсерций Р элемента

1.2.3. Механизмы влияния инсерции Р элемента на экспрессию генамишени

1.2.4. Условия транспозиции Р элемента. Тканеспецифичность

гибридного дисгенеза

1.2.5. Свойства белка транспозазы Р элемента
1.2.6. Роль белка I в процессе транспозиции Р элемента
1.2.7. Механизмы репарации двухцепочечных разрывов,
возникающих после вырезания Р элемента
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Генетическис скрещивания
2.1.1 Индукция перемещений Р элемента
2.1.2 Ввод и 4 мутаций в линии, содержащие различные аллели гена и .
2.2 Биохимические методы
2.2.1. . Выделение ДНК дрозофилы
2.2.2. Выделение фрагментов ДНК из геля
2.2.3 Блотгибридизация по Саузерну
2.2.4. Гибридизация на фильтрах
2.2.5. Молекулярное клонирование
2.2.5.1. Получение геномных библиотек
2.2.5.2. Выделение рекомбинантных клонов из геномной библиотеки.
2.2.5.3. Выделение ДНК рекомбинантного фага.
2.2.6 . Трансформация бактериальных клеток плазмидами
2.2.7 Выделение ДНК плазмид методом щелочного лизиса
2.2.8. Метод ПЦР.
2.2.9. Секвенирование плазмид и ПЦР продуктов.
2.2 I i г ибридизация ДНК с политенными хромосомами.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. инсулятор может блокировать взаимодействие между
энхансером и промотором, не находясь непосредственно между ними
3.1.1. Молекулярная структура мутаций в исходной линии 2тв
3.1.2. II инсулятор блокирует Энханссры в мутации 2 I, которая индуцирована инверсией между регуляторным районом гена и последовательностями
3.1.3. Роль различных доменов белка в блокирование взаимодействия между энхнасерами и промоторами в случае у1 1 мутации
3.1.4. инсулятор, расположенный в локусе , отвечает за блокирование энхансеров в 2I линии
3.1.5. Иисерция химерного элемента .1 т.п.н. между МДГ4 и промотором гена не влияет на блокирование энхансеров в 2 линии
3.1.6. Мутантный фенотип не зависит от ицсуляции энхансеров
3.1.7. Промотор гена отвечает за репрессию , и энхансеров С.
3.2. Механизмы образования химерных мобильных элементов
3.2.1. Молекулярный анализ дупликации последовательностей v между последовательностями Р элементов
3.2.2. Выяснение структуры Р элементов фланкирующих дупликации гена и анализ первичных последовательностей мест стыка дупликаций гена и Р элементов
3.2.3. Двух копий Р элемента ориентированных головакголове достаточно для эффективной дупликации последовательности гена
4. ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Способность инсулятора блокировать не изолированные энхансеры.
4.1.1. Особенности энхансерпромоторных взаимодействий
в районе
4.1.2. Новые свойства II инсулятора
4.2. Механизм образования химерных мобильных элементов.
4.2.1. Специфическое положение Р элементов вызывает частью дупликаци уникальных геномных последовательностей
4.2.2. Механизмы дупликаций гена между инвертированными элементами
4.2.3. Появление новых супериестабильных мутаций и их роль в эволюции
5. ВЫВОДЫ
6. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
ВВЕДЕНИЕ


Выяснение механизмов действия инсуляторов представляет интерес как в научном плане для выяснения принципов организации генома и регуляции экспрессии генов, так и в прикладном плане для создания векторов с независимой от окружающих последовательностей экспрессией генов Кояетап а1. Наиболее хорошо исследованный инсулятор находится в 5 области ретротранспозона МДГ4 дрозофилы. В настоящее время проводятся систематическое изучения действия инсулятора, расположенного на небольших дистанциях от промотора и энхансера. Задачей данного исследования было создание модельной системы для изучения действия инсулятора на регуляторные элементы, расположенных на больших дистанциях. Для этого были использованы модельные системы основанные на супернестабильных мутациях. У высших эукариог энхансер может активировать промотор на расстоянии, достигающем нескольких сотен тысяч пар нуклеотидов ОогзеИ Э . Большая часть существующих экспериментальных данных согласуется с тем, что белки, связанные с эихансером, непосредственно взаимодействуют с белками основного транскрипционного комплекса или вспомогательными белками, собранными на промоторе, при этом ДНК между ними образует петлю. Возникает вопрос, каким образом энхансер может взаимодействовать с промотором на больших дистанциях и при этом правильно узнавать свой промотор. Хотя к настоящему моменту описано огромное количество энхансеров и промоторов, изучено множество факторов транскрипции, вопрос о механизме взаимодействия между энхансером и промотором остается открытым. В понимании механизмов дальних взаимодействий между регуляторными элементами большую роль могут сыграть инсуляторы Рис. Иисуляторами называются регуляторные элементы, которые блокируют взаимодействие между энхансером и промотором, если находятся между ними ОогясМ О 1, Глазков М. В. . При этом инсуляторы не влияют непосредственно на активность энханссра и промотора, т. Са1 Н. В году были открыты первые два инсулятора дрозофилы, бсз и зсб, которые окружают ген теплового шока квр дрозофилы КеПиш Я. Рис. Основные свойства инсулятороа. Инсулятор инс блокирует взаимодействие между энхансерами соответственно эн1 и эн2 и промоторами соответственно пр1 и пр2, но не влияет непосредственно на активность Э1тхансера и промотора, б Инсулятор инс является границей между активным и не активным хроматином гетерохроматином. Инсулятор может блокировать прямое ингибирование репрессионным Рскомплсксом РсК промотора гена, а так же мешать кооперативному распространению более компактной структуры нуклеосом КН, которая инициируется в присутствии Рс комплекса. Рис. Схематическое изображение у мутации. Начало и направление экспресси гена показано стрелкой. Толстая линия определяет экзоны гена. Сокращения энкр,энт, энщ это соответственно энхансерм, которые определяют экспрессию гена в крыльях, теле и щетинках это инсулятор, который находится в 5 области мобильного элемента МДГ4. Почти одновременно в регуляторной области ретротранспозона дрозофилы МДГ4 был обнаружен инсулятор Р. К. . В дальнейшем у курицы был описан еще один инсулятор, который ограничивает глобиновые гены . Интересно, что он работает и в дрозофиле. Существуют данные, что инсулятор дрозофилы может функционировать в клетках мыши и ооцитах морского ежа Р. К. . Таким образом, инсуляторы из разных организмов должны иметь общие механизмы действия. В выяснении механизма действия инсуляторов большую роль сыграло определение белков, отвечающих за функцию инсуляторов. Впервые белки, которые блокируют взаимодействие между энхансером и промотором, были охарактеризованы для инсулятора. Этот инсулятор содержит сайтов связывания для одного белка, кодируемого, геном . Инактивация этого гена приводит к потере инсуляции. Сила инсулятора напрямую зависит от количества сайтов связывания для белка . Делеция даже нескольких сайтов связывания резко снижает эффективность действия инсулятора. ДНК связывающий домен, состоящий из цинковых пальцев i . С помощью делеционного анализа было выявлено, что за инсуляцию отвечает домен, расположенный между цинковыми пальцами и Сконцевым кислым доменом i . В то же время кислые домены белка не имели большого значения для инсуляции. Недавно были получены мутации в новом регуляторном гене 4 iv Р.