Характеристика свойств и функций белков-участников эндосомального транспорта рабаптина-5, его изоформ и VARP

• Автор: Пальгова, Ирина Викторовна
• Шифр специальности: 03.00.26
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 110 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Внутриклеточный мембранный транспорт.

1.2. Эндонигоз.

1.3. зависимое слияние мембран.

1.4. Семейство ГТФаз.

1.5. Молекулы, участвующие в ранних этапах везикулярного транспорта

1.5.1. Малая ГГФаза 5.

1.5.2. Малая ГТФаза 4.

1.5.3. Другие ГТФазы, участвующие в регуляции раннего эндоцитоза.

1.6. Факторы обмена гуаниновых нуклеотидов ГТФазы 5.

1.7. Рабаптин5подобные белки.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы.
2.1.1. Ферменты
2.1.2. Используемые реактивы.
2.1.3. Антибиотики.
2.1.4. Антитела
2.1.5. Растворы и буферы для электрофоретического разделения белков и ДНК
2.1.6. Клетки и плазмиды.
2.1.7. Растворы и буферы для выделения и плазмид.
2.1.8. Растворы и буферы для приготовления компетентных клеток.
2.1 буфср
2.1 Культуральные среды
2.2. Оборудование.
2.3. Методы исследований
2.3.1. Выделение плазмидной ДНК из . i протокол X
2.3.2. Выделение плазмидной ДИК из . i протокол 2 высокой очистки
2.3.3. Выделение плазмидной ДНК из клеток дрожжей.
2.3.4. Приготовление компетентных клеток . i
2.3.5. Приготовление компетентных клеток . i для электоропорации
2.3.6. Трансформация клеток .i
2.3.7. Электропорация клеток .i.
2.3.8. Трансформация клеток дрожжей.
2.3.9. Манипуляции с клетками дрожжей и
2.3 Трансфекция клеток линий и НЕК 3 .
2.3. Анатиз активации репортерного гена в дрожжах
2.3 Анализ активации репортерного гена i3 в дрожжах.
2.3 Иммуноцитохимический анализ.
2.3 Рестрикция
2.3 Обработка фрагментов ДНК фрагментом Кленова.
2.3 Выделение фрагментов ДНК из геля
2.3 Лигирование.
2.3 Определение нуклеотидных последовательностей
2.3 Электрофоретическое разделение белков в ДСНПААГ
2.3 Иммуноблот анализ
2.3. . Агарозный гельэлектрофорез
2.3 Полимеразная цепная реакция.
2.3 Получение плазмидных коистукций.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
3.1. Взаимодействие Рабаптина5 с малой ГТФазой И.аЬ5.
3.1.1. Ыконцевой домен Рабаптина5 способен образовывать гомодимеры
3.1.2. Идентификация и картирование нового сайта связывания ГТФазы Р.аЬ5 в Кконцевых доменах Рабаптина5, Рабаптина и Рабаптина5у.
3.1.3. Новая функциональная роль Рабаптина5 в процессе слияния ранних эндосом.
3.1.4. Резюме.
3.2. Изучение свойств белка гагр.
3.2.1. Взаимодействие Уагр с малой ГТФазой К.аЬ
3.2.1.1. Кконцсвая часть белка Уагр, содержащая Урз9домен, связывается с ГТФазой ЯаЬ5 в ее неактивном, ГДФсвязанном состоянии.
3.2.1.2. Локализация белка Уагр на мембранах ранних эндосом опосредует его Ктконцевой частью.
3.2.1.3. Локализация полноразмерного белка Уагр на плазматической мембране определяется его С концевым доменом
3.2.2. Поиск белковпартнеров по взаимодействию с Уагр
3.2.2.1. Взаимодействие УАЛР с белками семейства 4.
3.2.2.2. Взаимодействие Уагр с белком КапВР
3.3.3. Резюме.
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
5. ВЫВОДЫ.
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ivi i
I i
I iii iii
V x
iiiiv
i неорганический фосфат.
I3 iii
i
у i
i
у v vi i
, , , , у i
ГДФ гуанозиндифосфат
ГТФ гуанозинтрифосфат
дезоксиадснозинтрифосфат
у дезокснтимидинтрифосфат
дезоксиситозинтрифосфат
дезоксигуанозинтрифосфат
аминокислоты
АБ адапториые белки
ЕР эндоплазматический рстикулум
у рецептор фактор роста эпителия
фактор роста гепатоцитов
ОП оптическая плотность
ПЦР полимеразная цепная реакция
к ДНК комплементарная ДНК
ВВЕДЕНИЕ


Взаимодействие Уагр с малой ГТФазой К. Кконцсвая часть белка Уагр, содержащая Урз9домен, связывается с ГТФазой ЯаЬ5 в ее неактивном, ГДФсвязанном состоянии. Локализация белка Уагр на мембранах ранних эндосом опосредует его Ктконцевой частью. Взаимодействие УАЛР с белками семейства 4. Резюме. ЗАКЛЮЧЕНИЕ. ВЫВОДЫ. Одним из фундаментальных процессов, протекающих во всех эукариотических клетках, является транспорт мембран. Он затрагивает и влияет на самые различные аспекты жизнедеятельности клетки, такие как обмен веществ с окружающей средой, поддержание клеточного гомеостаза, секрецию, передачу сигналов и т. Тесная взаимосвязь мембранного транспорта с различными клеточными процессами определяет актуальность исследования его молекулярных основ. Для полноценной и нормальной работы клеток необходимо, чтобы процессы внутриклеточного мембранного транспорта были четко и тонко сбалансированы. Молекулярные основы везикулярного транспорта являются предметом исследования на протяжении длительного времени, однако расшифровка и характеристика всех участников этого многостороннего и сложного процесса еще далека от завершения. Представления о молекулярных механизмах внутриклеточного мембранного транспорта является необходимым не только для понимания этого фундаментального процесса самого по себе, но и сопряженных с ним событий. Это, в свою очередь, создаст основу для практического использования фундаментальных знаний в различных приложениях. ЯаЬ ГТФазы являются одним из основных классов молекул, регулирующих внутриклеточный мембранный транспорт. Регуляторные функции ЯаЬ ГТФаз осуществляются посредством их специфического взаимодействия с различными белками, называемыми эффекторами. Эффекторные молекулы очень обширная и во многом еще неизученная группа белков. ГТФаза ИаЬ5 играет ключевую роль в регуляции ранних этапов эндоцитоза мембранного транспорта от поверхности клетки. Кроме того, спектр этих молекул значительно шире, чем известно в настоящее время. Целью настоящей работы являлось исследование новых свойств и функций эффекторых молекул ГТФазы ЯаЬ5 белков Рабаптин5, его изоформ и белка Уагр. Исследовать новые функции Рабаптина5 и его кзоформ в процессе слияния ранних эндосом. Исследовать способность белка Уагр, нового потенциального фактора обмена гуашшовых нуклеотидов ГТФазы КаЬ5, взаимодействовать с ГТФазон КаЬ5. Провести поиск белков, взаимодействующих с белком Уагр. Внутриклеточный мембранный транспорт не только обеспечивает поступление в клетку и секрецию из нее различных молекул, но и поддержание клеточного гомеостаза, секрецию, передачу сигналов и т. Транспорт мембран характеризуется последовательным образованием и слиянием окруженных мембраной пузырьков везикул. Транспорт веществ из клетки называется экзоцитозом и характеризуется тем, что пузырьки сливаются с плазматической мембраной, и их содержимое высвобождается во внеклеточное пространство. Эндоцитоз, или процесс поглощения макромолекул характеризуется последовательным образованием и отделением от плазмалеммы мембранных пузырьков транспортируемых в клетку . Эндоцитоз и экзоцитоз всегда тонко сбалансированы в клетке, то есть мембраны везикул, а также молекулы, осуществляющие регуляцию движения везикул от одного компартменга клетки к другому в ходе эндоцигоза, могут быть возращены в первоночальный компартмент с помощью экзоцитоза. Везикулярный транспорт включает слияние первоначально разделенных участков бислоя и осуществляется, по крайней мере, в три стадии на первой мембраны взаимодействующих везикул стыкуются, затем происходит включение системы слияния, и, наконец, физическое слияние липидных бислоев, что приводит к смешиванию компонентов везикул . Клеточные мембраны никогда не сливаются самопроизвольно. Для того чтобы они слились, необходимо, чтобы молекулы воды были вытеснены взаимодействующими липидными бислоями, которые сближаются до расстояния 1,5 нм между собой. Это энергетически очень невыгодно, поэтому слияние всех мембран в клетке катализируется специальными белками слияния 3.