Адено-адено гибриды: получение, биологические свойства и молекулярно-генетический анализ

• Автор: Савицкая, Наталья Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.26
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 113 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений.

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Аденовирусы краткий обзор

2.1.1. Строение вириона

2.1.2. Белки вирпона. II

2.1.3. Аденовирусным геном.

2.2. Полный никл репродукции аденовирусов

2.3. Видоспецифичность размножения аденовирусов и

абортивная инфекция клетки.

2 4 Взаимодействие аденовирусов в условиях смешанной инфекции
2.5. Аденовирусный ген Е4 и его функции
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1 Материалы и методы
3.1.1. Материалы.
3.1.1.1. Химические реактивы.
3.1.1.2 Вирусы и клеточные культуры
3.1.1.3. Ферменты
3.1.2. Методы
3.1.2.1. Титрование вирусов
3.1.2.2 Нейтрализация вирусов
3.1.2.3 Очистка и концентрирование вирионов
3.1.2 4 Выделение вирионной ДНК
3 1 2.5 Выделение ДНК из клеток, зараженных аденовирусом.
3.1.2.6. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции
3.1.2.7 Фракционирование фрагментов ДНК в агарозных гелях
3.1.2.8. еренос ДНК на фильтры блоттинг
3.1.2.9. Приготовление зонда.
3 1.2 Гибридизация иммобилизованной на фильтрах ДНК
с меченой ИР ДНК.
3 1.2 Радиоавтография.
3.2. Результаты
3 2 I. Размножение и комплементация аденовирусов человека и обезьяны в
перевиваемых клетках обоих видов
3 2 2. Гибриды 28, полученные в клетках обезьяны .
3.2.2.1. Биологические свойства 28
3.2.2.2. Молекулярногенетический анализ гибрида 28.
3.2.3. Аденоадено гибриды 82, полученные в клетках человека
3 2.3.1 Получение аденоадено гибрида 82 к ею биологические свойства
3.2.3 2 Молекулярногенетический анализ гибрида 82
3 2 4 Роль аденовирусного гена Е4 в видоспецифичности репродукции
аденовирусов.
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Разделить эти два типа частиц в обезьяньих клетках невозможно, так как они составляют взаимно комплсмснтируюшую пару. Между тем, аденоадено гибридные частицы должны содержать гены аденовируса обезьяны, способные помогать продуктивной инфекции аденовируса человека в обезьяньих клетках. Природа этих генов оставалась полностью неясной. Очевидно, что изучение молекулярной природы гибридных частиц может пролить свет на роль определенных аденовирусных генов в видоспсцифичности их размножения. Кроме того, изучение аденоадено гибридов способно помочь в понимании механизма аденовирусного канцерогенеза и природы опухолевых антигенов Т и ii i i . Получить дефектные аденоадено гибриды при совместном размножении вьгеокоонкогенного обезьяньего аденовируса 78 и аденовируса человека типа 2 2 в перевиваемых клетках обезьяны. Получить несколько десятков клонов этих гибридов и изучить природу их генома методом молекулярной гибридизации, определить гены аденовируса обезьяны, локализованные в геноме гибридных частиц. Изучить взаимодействие аденовируса обезьяны 78 и аденовируса человека 2 в перевиваемых клетках человека. Определить природу вирионов, образующихся при смешанной инфекции в этой системе. В результате проведенной работы было показано, что аденоадено гибриды, полученные в обезьяньих клетках, содержат левую половину генома аденовируса человека и правую часть генома аденовируса обезьяны. Е4 и Е2а, потенциально способных участвовать в определении видоспецифичности аденовирусной репродукции. Роль одного из них, гена К4, была доказана экспериментально. При изучении совместной инфекции аденовирусов обезьяны и человека в клетках человека впервые была установлена комплементация между ними и способность генома аденовируса человека переодеваться в капсид аденовируса обезьяны транскапсидация. Был выявлен дефектный адсноадсно гибрид, способный служить помощником для аденовируса обезьяны в клетках человека. Природа его генома отличалась от природы генома гибридов, полученных в клетках обезьяны. Настоящая работа выполнена в лаборатории генетики вирусов Института биологии гена РАН. Некоторые разделы настоящей работы выполнены совместно с сотрудниками этой лаборатории к. Н.Ф. Гриненко и к. Г.В. Пашвыкиной. Автор приносит глубокую благодарность своему научному руководителю профессору Л. Д. Альтштейну и всем сотрудникам лаборатории генетики вирусов за постоянную помощь и поддержку. ГЛАВА 2. Аденовирусы краткий обзор. Аденовирусы частая причина острых инфекций верхних дыхательных путей. Они также вызывают поражение ряда других орг анов. Впервые аденовирусы были выделены в году американскими исследователями, пытавшимися получить клеточные линии из детских аденоидных тканей, удаленных при тонзилэктомии и от солдат с легочными заболеваниями . В году были выделены аденовирусы в культуре клеток человека от больных ОРЗ и атипичной пневмонией Ii, . Семейство аденовирусов состоит из многих различных серологических типов, которые являются возбудителями ОРЗ, фарингоконъюнктивальной лихорадки, конъюнктивитов и других поражений дыхательного тракта, глаз, лимфоидной ткани и кишечника. Аденовирусы вызывают не только острые, но и хронические, и латентные инфекции , . Аденовирусы изолированы от большого числа животных и птиц, являющихся их естественными хозяевами. В начале семидесятых годов было показано, что некоторые аденовирусы индуцируют опухоли у хомяков, что вызвано значительный интерес, поскольку это очень распространенные вирусы i . . Позднее было обнаружено, что аденовирусный онкогенез скорее всего является лабораторным феноменом и, повидимому, не встречается у людей . Аденовирусы являются важной модельной системой изучения молекулярной биологии и генетики эукариотических клеток и других вирусов. Так, именно на модели аденовирусов был открыт сплайсинг i, , . Также в настоящее время интенсивно изучается возможность использования аденовирусов в качестве векторов для генной терапии.