Влияние векторной составляющей на цитотоксическую активность и внутриклеточный транспорт конъюгатов, содержащих каталитическую субъединицу рицина

• Автор: Венедиктова, Ольга Алексеевна
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 110 с. : ил.

Содержание

Список сокращений

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1 Современные предсгавления о плазматических 9 мембранах. Многообразие внутриклеточных путей.

1.2 Внутриклеточный транспорт рицина.

1.3 Эпидермальный фактор роста и трансферрин

1.4 Рецепторы эпидермального фактора роста и трансферрина.

1.5 Внутриклеточный транспорт ТБИ и ЕСШ.

1.6 Современные подходы к синтезу и использованию препаратов направленного действия.

Заключение.
Глава 2. Материалы и методы.
2.1 Материалы.
2.2 Методы.
2.2.1. Клеточные линии.
2.2.2 Получение гибридом.
2.2.3 Системы ТИФА.
2.2.3.1 Твердофазный иммунофсрмснтный анализ для определения реакции антител с биотинилированными антигенами.
2.2.З.2. СэндвичТИФА для выявления свободной
каталитической субъединицы рицина.
2.2.4 Биотинилированис белков.
2.2.5 Очистка моноклональных антител мАт.
2.2.6 Иммобилизация мАт 2ЯВК1 па ВгСЫактивированную сефарозу 4В.
2.2.7 Дополнительная очистка .
2.2.8 Клеточные лизаты и супернатанты.
2.2.9 Трансфекция клеток линий А1.
2.2. Электрофорез в ПААГ.
2.2. Конъюгаты и .
2.2. Получение конъюгатов траисферрина Тф, i , рицина и его субъединиц с различными флуорохромами.
2.2. Реассоциация субъединиц токсинов.
2.2. Цитотоксический тест.
2.2. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия.
Глава 3. Результаты и обсуждение.
3.1. Гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела, дискриминирующие от нативного токсина.
3.2 Дополнительная очистка субъединиц рицина.
3.3 Сравнительный анализ внутриклеточного распределения рицина и различных векторных молекул.
3.3. Цитотоксическая активность конъюгатов и
.
3.4 Сравнительный анализ взаимодействий рицина,
вискумина и химерных молекул и с клетками.
3.4.1. Различия во взаимодействии рицина и вискумина с клеточной мембраной.
3.4.2. Цитотоксическая активность химерных молекул и .
Выводы.
Список литературы


Связывающая субъединица рицина 1ШЗ не только обуславливает взаимодействие молекулы с поверхностью клетки, но и направляет ее в клеточные компартменты, откуда происходит транслокация каталитической субъединицы ТА в цитозоль, в результате чего Б. ТА достигает своей клеточной мишени рибосомы. Взаимодействие ЯТА с рибосомой приводит к остановке синтеза белка и гибели клетки. Особый интерес представляют данные сравнительного анализа внутриклеточного пути и биологической активности рицина и его структурного и функционального аналога вискумина I , . Активность каталитической субъединицы вискумина в бесклсточной системе сопоставима с активностью ii , . Сравнительный анализ внутриклеточного транспорта нативного рицина и различных конъюгатов на основе позволит получить информацию о роли векторной части РИБ и их производных в интоксикации клетки. Эта информация необходима для создания нового поколения препаратов направленного действия, обладающих высокой специфической цитотоксической активностью и незначительными побочными действиями при клиническом применении. Разработать методы дополнительной очистки и контроля чистоты препаратов субъединиц рицина. Синтезировать и провести очистку конъюгатов трансферрин , эпидермальный фасгор роста , а также химерных молекул , . Провести сравнительный анализ внутриклеточного транспорта , трансферрина, рицина и вискумина. Оценить цитотоксическую активность , , , , а также нативных молекул рицина и вискумина. Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые проведен сравнительный анализ циготоксичсской активности конъюгатов с векторными молекулами, определяющими ее доставку в различные клеточные компартменты. Показано, что наибольшей цитотоксичсской активностью обладали конъюгаты, содержащие вектор, который направляет в комнартмеит, вовлеченный в транспорт основного пула нативного рицина. Полученная информация важна для разработки дизайна иммунотоксинов нового поколения. Синтезированные конъюгаты и представляют собой потенциальные терапевтические агенты. Нами показано, что рицин влияет на внутриклеточный транспорт , снижая процент молекул, попадающих в лизосомы. Совместно с к. Е.Н. Поповой получена серия моноклональных антител, дискриминирующих изолированную каталитическую субъединицу рицина от нативного токсина. На основе этих антител разработана тсстсистема, позволяющая выявлять нанограммовые количества в присутствие нативного рицина. Разработаны методы дополнительной очистки компонентов цитотоксическнактивных конъюгатов, позволяющие в дальнейшем минимизировать побочные эффекты при применении их в терапии онкологических заболеваний. Глава 1. Обзор литературы. Современные представления о плазматических мембранах. Многообразие внутриклеточных путей. Наше представление о клеточных мембранах как липидных бислоях является результатом столетних исследований. Однако недавние исследования различных мембранных структур клетки существенно изменили картину. В модели бислойной мембраны х годов клеточные мембраны представляют собой жидкий липидный бислой, в котором находятся различные белки. Бислой очень динамичен липиды и белки могут сгибаться, вращаться и латерально диффундировать в двумерной жидкости. Жидкость изотропна, т. Липиды создают физическую поддержку мембранам органелл, действуя как барьер для водорастворимых молекул и как растворитель для гидрофобных доменов мембранных белков. Внося вклад во внутренне присущие свойства мембран, такие как толщина, асимметричность и изогнутость, липиды могут потенциально регулировать движение и распределение белков ОгиепЬе, . Липиды, непосредственно окружающие мембранный белок могут влиять на функцию белка, это возможно объяснить довольно большим количеством типов липидов до 0 1,0, которые присутствуют в одиночной мембране. Однако эта гипотеза не предусматривала возможности неслучайного распределения липидов в мембранах и не принимала во внимание исследования по локальной упорядоченности некоторых типов липидов ЕБс1т, .