Клеточные структуры, вовлеченные в транспорт рибосом-инактивирующих белков II типа

• Автор: Козловская, Наталия Валерьевна
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 158 с.

СОДЕРЖАНИЕ
СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Клатринзависимый эндоцитоз

1.2. Клатриннезависимый эндоцитоз

1.2.1. Макропиноцитоз

1.2.2. Эндоцитоз, опосредованный липидными рафтами и кавеолами

1.3. Везикулярный транспорт, сортинг и рециклинг

1.3.1. Малые ГТФазы гаЬ

1.3.2. Ранние, или сортинговые, эндосомы
1.3.3. Перинуклеарный рециклинговый компартмент
1.3.4. Внутриклеточный транспорт структур, опосредующих клатриннезависимую интернализацию молекул
1.3.4.1. Структуры, эндоцитоз которых опосредован кавеолами и липидными рафтами
1.3.4.2. Структуры, интернализованные посредством макропиноцитоза
1.3.5. Ретроградный транспорт
1.4. Основные этапы гликозилирования мембранных и секреторных
белков в клетках млекопитающих
1.4.1. Ысвязанные олигосахариды
1.4.2.0связанные олигосахариды
1.4.3. Гликозилирование в АГ
1.5. Рибосоминактивирующие белки II типа как инструмент для изучения внутриклеточных процессов
1.5.1. Рицин
1.5.2. Вискумин
1.5.3. Взаимодействие РИБН с плазматической мембраной и
внутриклеточный транспорт токсинов
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы
2.2. Клетки
2.3. Получение моноклональных антител, взаимодействующих с токсинами не по принципу антигенантитело, а по принципу лектинлиганд
2.4. Трансфекция клеток линий А1 и ЗТЗ
2.5. Получение конъюгатов рицина и вискумина с флуорохромами ФИТЦ
и А1еха8
2.6. Проведение электрофореза
2.7. Изучение поливалентного связывания лектинов с лигандами
2.8. Оценка возможных конформационных изменений, произошедших в результате конъюгации рицина и вискумина с флуоресцентными красителями
2.9. Определение лектиновой активности рицина и конъюгатов рицина и вискумина
2 Оценка цитотоксической активности конъюгатов рицина и
вискумина с флуорохромами
2 Оценка возможных изменений внутриклеточного транспорта рицина, произошедших в результате трансфекции, с помощью МТТтеста
2 ТФИФА на клетках
2 Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия
2 Иммунофлуоресценция
2 Атомносиловая микроскопия АСМ
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
3.1. Конъюгация рицина и вискумина с флуоресцентными красителями ФИТЦ и А1еха8 не привела к изменениям их иммунохимических, биохимических и биологических свойств
3.2. Взаимодействие рицина и вискумина с рецепторами клеточной
поверхности в модельных системах
3.2.1. Рицин и вискумин взаимодействуют с разными участками
поверхности фиксированных клеток
3.2.2. Связывание лектинов с лигандами в бесклеточных модельных системах
3.2.2.1. Получение гибридом, продуцирующих гликозилированные моноклональные антитела, с кардогидратной частью которых взаимодействуют углеводсвязывающие центры рицина и вискумина
3.2.2.2. Взаимодействие рицина и вискумина с гли кози лированными моноклональными антителами
3.2.2.3. Взаимодействие рицина и вискумина с асиалофетуином
3.2.2.4. Изучение организации трехмерных структур, создаваемых гликозилированными антителами
3.3. Различное распределение рицина и вискумина во внутриклеточных компартментах
3.4. Участие эндосомального компартмента в транспорте рицина
3.4.1. Трансфекция клеток линии А1 не влияет на внутриклеточный транспорт рицина
3.4.2. После интернализации рицин проходит через гаЬ4гаЬ5позитивный эндосомальный компартмснт, характеризующийся низким содержанием
гаЫ 1
3.4.3. Трансферрин и рицин проходят через одни и те же ранние эндосомы
3.4.4. Пути рицина и трансферрина расходятся на поздних этапах
эндосомального транспорта
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Содержание двух галактозсвязывающих центров в Всубъединице обусловливает осуществление как моно, так и бивалентного взаимодействия рицинлиганд. Другой представитель семейства РИБН вискумин может иметь как димерную, так и тетрамерную организацию. Возможность существования вискумина как тетрамера и наличие четырех углеводсвязывающих центров в
одной его молекуле также создают предпосылки для осуществления мультивалентного взаимодействия данного лектина с разнообразными лигандами. Строение РИБН позволяет использовать их при изучении особенностей связывания лектинов, в том числе и мультивалентных взаимодействий, с углеводами, а также при исследовании структурной организации плазматической мембраны, отличающейся гетерогенностью и неоднородностью распределения элементов на ее поверхности. После связывания с рецепторами клеточной поверхности РИБН подвергаются как клатринзависимому, так и клатриннезависимому эндоцитозу. Данные процессы опосредованы разными клеточными структурами, предопределяющими дальнейшую внутриклеточную судьбу интернализованных молекул. Гольджи АГ vi, v , . Финальным этапом внутриклеточного транспорта рицина является диссоциация от Всубъединицы цепи и транслокация ее в цитозоль, где цепь действует как фермент, выщепляя остаток аденина из рибосомалыюй РНК, что приводит к остановке синтеза белка в клетке ii . Механизм и место транслокации Асубъединицы в цитозоль в настоящее время изучены не полностью. Существует ряд доказательств осуществления транслокации из ЭР в цитоплазму с использованием механизмов экспорта неправильно свернутых белков для последующей деградации , ii, . Изза структурного сходства с рицином для вискумина предполагают механизмы интернализации и внутриклеточного транспорта, аналогичные таковым у рицина. ЭР. Кроме того, изучение внутриклеточного транспорта токсинов и структур, опосредующих его, может быть полезно для решения ряда прикладных задач, включая создание препаратов направленного действия иммунотоксинов и противовирусных вакцин нового поколения. Целью работы было исследование клеточных структур, участвующих в транспорте РИБП. Сравнить взаимодействие сходных по структуре РИБН рицина и вискумина с клеткамимишенями. Разработать модельные системы для изучения особенностей взаимодействия лектинов с углеводами, организованными в трехмерные надмолекулярные структуры. Получить клеточные линии, экспрессирующие малые ГТФазы как маркеры функциональных доменов эндосомального компартмента. Использовать полученные клеточные линии для изучения ранних этапов транспорта токсинов. Выявить внутриклеточные компартменты, вовлеченные в транспорт токсинов. ГЛАВА 1. Клатринокаймленные участки мембраны вовлечены в формирование транспортных везикул, которые движутся от плазматической мембраны или тдсГольджи сети ТГС к эндосомальному компартменту i, i, , . На плазматической мембране функция клатринокаймленных ямок заключается в избирательной концентрации и последующей интернализации белков, либо обеспечивающих клетку питательными веществами, либо участвующих в регуляции экспрессии рецепторов мембраны. Агрегация клатрина в корзинкообразные решетки на цитоплазматической стороне мембраны инициирует формирование окаймленной ямки, в результате чего участок мембраны, покрытой клатриновым слоем, образует окаймленную везикулу i, i, . Главными белками, которые управляют формированием клатриновой оболочки, являются комплексы АР1 и АР2 i, или адаптеры, имеющие многофункциональное значение для везикулярного транспорта i, i, , . Комплекс АР1 найден в везикулах, отщепляющихся от трансГольджи сети, тогда как комплекс АР2 специфичен для окаймленных везикул плазматической мембраны. Комплексы АР1 и АР2 представляют собой гетеротетрамеры. В их состав входят две большие цепи у и либо i, либо Р2адаптин для АР1 и а и либо Р1, либо р2адаптин для АР2, средняя цепь i или р2 и маленькая цепь а 1 или с2. Цепи i и р2 узнают тирозинсортинговые сигнальные последовательности, присутствующие в цитоплазматическом участке белков, которые проходят черех клатринокаймленные везикулы .