Особенности внутриклеточного транспорта растительных токсинов, используемых в составе иммунотоксинов

• Автор: Малюченко, Наталия Валериевна
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 151 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений

Введение.

Г лава 1 Обзор литературы

11. Токсины растения Vi .

1 Строение токсинов из растения Vi .

1.1.2. Ферментативная субъединица

1.1.3. Связывающая субъединица.

1 Зона контакта субъединиц

1.2. Внутриклеточный транспорт токсинов

1.2.1. Интернализация токсинов.

1.2.2. Прохождение токсинов через эндосомальный компартмснт .
1.2.3 Формирование и слияние везикул.
1.2.4. Транспорт в аппарате Гольджи
1.2.5 Ретроградный транспорт в эндоплазматический ретикулум
1 2 6 Транслокация токсинов
1.2.7. Альтернативные пути транспорта
1.3. Иммунотокснны в терапии меланомы.
1.3.1. Белки меланомы
1.3 2 Высокомолекулярный меланомоассоциированный антиген
1.3.3. Иммунодиагностика и имму нотерапия меланомы.
1.3 4 Иммунотокснны к меланоме.
Г лава 2. Материалы и методы
2 1. Клетки и антитела.
2.2. Выделение токсинов и их субъединиц из растения ii
i.
2 3 Выделение токсинов и их субъединиц из растения Vi
2 4 олучение гибридом, продуцирующие моноклональные ант тела к
нативной форме Асубьединнцы внекумина
2 5 олучение гибридом, продуцирующие моноклональные антитела к
денатурированной форме Асубьсдиницы внекумина
2.6. Получение и очистка антител.
2 7 Изучение взаимодействия антител с антигеном на плате с помощью
2.8 Изучение взаимодействия антител с нативной и денатурированной
формой антигена с помощью ТИФА
2.9. Конкурентный ТИФА.
2 СэндвичТИФА на основе монАт серии
2 Определение констант взаимодействия монАт с антигеном в
растворе.
2 Определение взаимодействия монАт с антигеном, сорбированного на плату.
2 Иммуноблогтинг
2 Предсказание и синтез пептидов
2 Пептидный ТИФА
2, Получение и очистка иммунотоксинов.
2 Иммунофлюоресценция.
2 Клеточный ТИФА
2. Оценка цитотокснческой активности токсинов и иммунотоксинов
2. Приготовление аффинной колонки с монАт VI .
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1. Гибридомы, продуцирующие антитела к нативной форме .
3.1.1 Получение гибридом
3.1.2. Свойства монАТ серии ША
3 1.3. Устойчивость гибридом к цнтотоксическому действию внекумина.
3.1.4. Устойчивость гибридомы МХА5
3.1.5. Использование монАТ серии ША в создании тестсистемы
3.2 Гибридомы, продуцирующие антитела к денатурированной
форме 1ЬА
3.2.1 Получение гибридом
3.2.2 Свойства антител
3.2.3 Картирование эпитопов.
3.2.4. Устойчивость гибридом
3.3. Иммунотокснны. направленные к НМУМАА.
3 Получение ИТ.
3.3.2. Специфичность связывания ИТ.
3.3.3. Связывающая активность ИТ.
3 3 4 Оценка цитотокснческой активности ИТ.
3 3 5 Использование различных агентов, усиливающих
цитотоксичность ИТ.
3.3.6. Очистка ИТ на антнндиотипичсской колонке.
Заключение.
Выводы.
Список литературы


Характерными особенностями РИБ П типа являются 1строенне, 2 механизм действия данные белки способны связываться с клетками через рецепторы и доставлять в цитозоль полипептид, который вызывает необратимую остановку системы синтеза белка и гибель клетки, 3 их специфичность к галактозе. Вискумин, или иначе i i I I был выделен из листьев растения Vi Кроме того, экстракты омелы содержат родственные вискумнну белки . II. . I i i II и III , , а также вискотоксины. С, тритерпен и флавононды i . Три лсктина I, II. II обнаруживают гомологию первичных структур, как это было показано в результате анализа терминальных последователыюсгей данных белков ii . До настоящего момента обнаружен только один геи, кодирующий лекган i. II и III являются результатом посттрансляциониого процессинга I . i . Криопротсктивными свойствами обладали некоторые белки из семейства РИ, к примеру, агглютинин абрина и рицин. Предполагаегся гакже, что рибосоминактивнруклцие белки необходимы растению как защита от бактериальной и грибной инфекции ii . Вискумин, подобно всем РИБ. А и Всубьединицы и V1 схпвсгсгвенно, имеющих молекулярный вес около кДа Таким образом вое голотокенна кДа Первым белком из семейства РИБ для которого была создана пространственная модель, основанная на рснтгеносгрукгурном анализе, был рицин . Ремтгенострукгурное исследование молекулы I в нативном состоянии при разрешении 3,5 А позволило создать просганственную модель вкскумина Всрнословаи др. . Молекула I имеет размеры примерно 0А х А х А В то время как Асубъеднннца состоит из а и р элементов вторичной структуры, в Всубъединице обнаруживаются только ртяжи. В составе Асубъединииы внекумнна можно выделить три домена Домен I состоит из одного спирального участка и семи Ртяжей Второй домен составлен пятью спиральными участками Третий домен содержит один спиральный участок и два ангнпаралелльных Ртяжа В Асубьединице рицина, имеющей также трехдомсннос строение, в третьем домене отсутсвуют РТЯЖИ Веронословаи др. Всубьеднннца внекумина, как и у многих РИБ1, состоит из двух идентичных глобулярных доменов. Vi . Субдомены расположены енммефнчно относительно локальной оси квазитретьего порядка н образуют структуру т. i . При концентрациях выше 1 мгмл I существует в виде димеров, при 0,3 и 0. Iдимеры составляют и соответственно В то время как и ЛИ остаются мономерами Рицин, имеющий гомологии с вискумнном. . Болес детальные исследования структуры димеров вискумина показали, что взаимодействие двух молекул 1 происходит засчег нсковалетнон ассоциации Всубьеднниц. АВВА Тетрамерное образование формируется, в основном, за счет сильных гидрофобных и полярных взаимодействии между первыми доменами Всубьдиннц молекулы вискумина Вернослова и др Константа ассоциации К,М . I8. Значение тетрамернзацнн молекул вискумина осгаезся невыясненным, существует предположение, что ассоциация мономеров обеспечивает взаимодействие i между клетками . РИБ II являются гликопротсинами Углеводная часть токсинов из омелы достаточно хорошо охарактеризована таблица 1 i . ацстилманнозамт, фукозу и ксилозу . I I Углеводы лсктииов i омелы белой В1ЯПЗ из статьи ипшепчапп. В 1ТЛЛ . ЛОЯС КДЛ , кДа 4. Состав у неводов Одна бокова цеп, с . Да 8. I. III . углеводов 0. Состав уг. VI. Аминокислотная последовательность включает 4 остатка i , . . А содержит один , участвующий в образовании днеуяьфидной связи с Всубьедншшей. треинке дисульсуфидные связи в отсутствуют. В ходе исследований были составлены две первичные последовательности А, которые, как предполагают вызваны существованием изоформ . Данные изоформы отличаются по крайней мере заменами таблица 2. 2 приводит к элиминации сайта глнкозилирования . Таблица2 Замены а о в последовательностях . Л.АМ1,Автз i . Iii Углеводная компонента имеет вес .