Участие микротрубочек в регуляции актинового цитоскелета в клетках эндотелия

• Автор: Смурова, Ксения Михайловна
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 130 с. : ил.

Введение

Обзор литературы

Микротрубочки

Строение микротрубочек

Тубулин способен полимеризоваться i vi

Полярность микротрубочек

Динамическая нестабильность

Трэдмиллинг
Описание динамики отдельной микротрубочки и сети цитоплазматических микротрубочек в целом

Стабильные микротрубочки

Белки, ассоциированные с микротрубочками

МАР белки
Моторные белки
Минусконцевые белки
Плюсконцевые белки
Актин спонтанно полимеризуется i vi
При образовании акгинового филамента происходит гидролиз АТФ
Актиновый филамент обладает полярностью
Белки, взаимодействующие с мономерным актином
Белки, взаимодействующие с актииовыми филаментами
Миозины
Образование новых филаментов
Полимеризация актина приводит к движению клеточной мембраны
Актинсвязывающие белки i viv
Актиновые структуры в клетке
Ююбелки
Общие свойства микротрубочек и актина
Взаимодействия микротрубочек и актина
Регуляторные взаимодействия
Структурные взаимодействия
Микротрубочки и актиновые филамснты в районе контактов
В нутриклеточный транспорт 3
Эндотелий
Тромбин
Г етеротримерные вбелки 3
Цитоскелет эндотелиальных клеток при действии тромбина
Цель и задачи работы
Материалы и методы
Культура клеток
Трансфекция
Экспериментальные воздействия
Иммунофлюоресцентное окрашивание
Получение и обработка цифровых изображений
Количественная оценка системы актиновых филаментов и микротрубочек Анализ системы микротрубочек в клетках Уего
Измерение длин микротрубочек в цитоплазме клеток Уего
Анализ интенсивности флуоресценции тубулина в ламелле клеток Уего Моделирование системы микротрубочек
Статистическая обработка данных и построение графиков
Результаты
Актин и микротрубочки в нативных клетках эндотелия человека
Микротрубочки
Ацетилированные микротрубочки
Тирозилированные микротрубочки
Действие наномолярных доз нокодазола на цитоскелет клеток эндотелия
Действие нокодазола в концентрации 0 нМ
Действие нокодазола в концентрации 0 нМ
Действие тромбина на цитоскелст клеток легочного эндотелия человека
Актиновые филаменты при действии тромбина
Площадь клеток при действии тромбина
Микротрубочки при действии тромбина
Сравнение действия нокодазола и тромбина на цитоскелет клеток эндотелия Гиперэкспрессия асубъсдиниц белков 2, и вч приводит к деполимеризации микротрубочек
Ингибирование белка приводит к снижению эффекта тромбина на стрессфибриллы и микротрубочки
Цитоскелет клеток эндотелия при действии нокодазола и тромбина в присутствии активатора аденилатциклаз
Цитоскелет эндотелиальных клеток при действии форсколина
Цитоскелет эндотелиальных клеток при действии нокодазола в присутствии форсколина
Цитоскелет эндотелиальных клеток при действии тромбина в присутствии форсколина
Цитоскелет клеток эндотелия при действии нокодазола и тромбина в присутствии ингибитора Шюкиназ
Цитоскелет эндотелиальных клеток при действии ингибитора Ююкиназы У2
Цитоскелет эндотелиальных клеток при действии нокодазола в присутствии У
Цитоскелст эндотелиальных клеток при действии тромбина в присутствии У2 Анализ системы микротрубочек в цитоплазме клетки по интенсивности флуоресценции тубулина
Моделирование системы микротрубочек
Экспериментальная проверка модели
Оценка состояния системы микротрубочек в норме и при действии тромбина с помощью измерения интенсивности флуоресценции в клетках эндотелия
Обсуждение результатов
Взаимодействия микротрубочек и актина в клетках эндотелия
Участие микротрубочек в передачи сигнала от тромбина к актиновому цитоскелету
Новые подходы к изучению системы микротрубочек в культивируемых клетках
Выводы
Слисок литературы
Введение


Воздействие тромбина на фоне ингибирования КЪокиназы увеличивает площадь, занятую стрессфибриллами, но не до исходного значения, тогда как микротрубочки разбираются при действии тромбина вне зависимости от присутствия ингибитора Шюкиназ. Действие тромбина не только элиминирует периферические микротрубочки, но и меняет их распределение в центре клетки. Наши результаты позволяют предположить, что тромбин регулирует актиновый цитоскелет эндотелиальных клеток через КЬоЮюкиназный путь, где в качестве промежуточного звена выступает деполимеризация микротрубочек на краю клетки. Микрогрубочки особые клеточные структуры, обладающие характерным строением и являющиеся одним из составляющих цитоскслста. Микротрубочки играют важную роль в процессах внутриклеточного транспорта, поддержании клеточной формы и в клеточном движении. Во время митоза микрогрубочки формируют митотическое веретено и участвуют в перемещении хромосом. Микрогрубочки представляют собой полые неветвящиеся цилиндры с внешним диаметром нм и внутренней полостью диаметром нм рис. Молекула тубулина представляет собой гетеродимер, риСунок . Размер димера тубулина составляет 4x8 нм. В животной клетке встречается, по меньшей мере, шесть изоформ а и тубулина . Каждый а и мономер имеет сайт связывания с одной молекулой I IФ. Один из них, находящийся субъединице, является обмениваемым, в отличие от сайта связывания, локализованного на асубъединице , . По мере роста микрогрубочки ГТФ гидролизуется до ГДФ и . В результате на растущем конце микротрубочки всегда имеется участок из не гидролизованного тубулина. Рисунок 2. В процессе сборки микротрубочек возникает два типа контактов между тубулиновыми димерами продольные контакты головахвост между двумя димерами в протофиламенте и латеральные между двумя параллельными протофиламентами. Продольные контакты более сильные, чем латеральные, поэтому при деполимеризации полимера происходит отслаивание фрагментов протофиламентов от конца микротрубочки . Кроме тубулина в состав микрофубочек входят белки, ассоциированные с микротрубочками белки i i i. Их состав варьирует в зависимости ог клеточного т ипа. Очищенный тубулин полимеризуется i vi при1В7в присутствии 2 и . Выделяют 3 фазы полимеризации нуклеация, элонгация и равновесное состояние рис. В течение первых двух стадий преобладает полимеризация микротрубочек за счет высокой концентрации свободного тубулина. Со временем, система приходит в равновесное состояние. Типичный фибробласт содержит губулин в концентрации
рМ из которого около находится в полимеризованной форме и около в растворенной . В опытах по полимеризации растворенного тубулина, выделенного из мозга быка, на фрагментах аксонем ресничек , i, было показано, что на одном конце затравки микротрубочки растут быстрее, чем на противоположном. Быстро растущие концы микротрубочек были названы плюсконцами, а медленно растущие минусконцами. Полярность микротрубочек обусловлена различной ориентацией субъединиц а и тубулинов в ее составе. На краю плюсконца находятся субъединицы, а на краю минусконца асубъединицы. Явление динамической нестабильности i iii было описано впервые в работах Митчизона и Киршнера в году ii, i, . Согласно теории динамической нестабильности Митчизона и Киршнера на обоих своих концах микротрубочки находятся в состоянии постоянной полимеризациидеполимеризации. Скорость сборкиразборки на плюсконце значительно выше, чем на минусконце. Собственно, чередование фаз сборки и разборки и получило название динамической нестабильности. Суть явления динамической нестабильности такова после включения молекулы тубулина в состав микротрубочки происходит гидролиз ГТФ, связанного с тубулином, до ГДФ. Молекулы тубулина, несущие ГТФ, прочнее связываются с концом микротрубочки имеют большее сродство и имеют меньшую конеганту диссоциации. При быстром росте микротрубочки происходит запаздывание гидролиза, поэтому на быстро растущем конце образуется шапочка из ГТФ, препятствующая разборке и способствующая росту микротрубочки. При уменьшении скорости роста происходит полный гидролиз ГТФ на тубулине, и микротрубочка начинает укорачиваться.