Влияние липидов на индуцированный апоптоз моноцитов в норме и при раке молочной железы

• Автор: Ромашкина, Марина Васильевна
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Саранск
• Количество страниц: 122 с. : ил.

Содержание
Введение

Г лава 1. Обзор литературы

1.1. Морфологические особенности и молекулярногенетическая

организация моноцитов и макрофагов

1.2. Молекулярно генетический механизм апоптоза

1.2.1 Генетические аспекты программируемой клеточной гибели

1.2.2. Молекулярные механизмы передачи информации в ядро клетки

1.3. Влияние липидов на генетические процессы

1.3.1 Роль липидов в рецепции и внутриклеточной сигнализации

1.3.2. Эффекторные пути в регуляции апоптоза. Роль липидных доменов в функционировании клеточных рецепторов
1.3.3. Фагоцитоз погибающих клеток
1.3.4. Липиды ядра клеток в норме
1.3.5. Липидный состав ядер раковых клеток 3
1.4. Рак болезнь генома. Апоптоз и рак
1.4.1. Ключевые гены, мутации в которых, предрасполагают к
раку молочной железы
1.4.2. Апоптоз при онкологических заболеваниях
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Материалы исследования
2.1.1. Объект исследования
2.2. Методы исследования
2.2.1. Выделение моноцитов из гепаринизированной крови
2.2.1.1 .Постановка эксперимента
2.2.2. Определение жизнеспособности клеток
2.2.3. Выделение ДНК ядерных клеток крови
2.2.4.Электрофорез ДНК моноцитов в агарозном геле
2.2.5. Приготовление агарозного геля
2.2.6. Световая и флуоресцентная микроскопия моноцитов
2.2.7. Окрашивание моноцитов по ПаппенгеймуКрюкову
2.2.8. Окрашивание моноцитов акридиновым оранжевым
2.2.9. Окрашивание моноцитов
2.2 Получение липосом
2.3.Проведение полимеразной цепной реакции ПЦР
2.3.1. Проведение ПЦР для определения мутации i в экзоне гена
2.3.2. Проведение ПЦР для определения мутации 5 во 2 экзоне гена
2.3.3. Проведение ПЦР для определения мутации в экзоне гена
2.3.4.Проведение ПЦР для определения мутации в экзоне
2.3.5. Проведение ПЦР для определения мутации р
2.3.6. Методика проведения электрофореза в ПААГе
2.3.7. Окраска геля
2.3.8. Молекулярное моделирование взаимодействия липидов с ДНК
2.3.9. Постановка обратной транскрипции
2.3 Статистическая обработка данных Глава 3. Результаты исследований
3.1 Морфологические особенности моноцитов в норме и при раке молочной железы
3.2. Выявление частот мутантных аллелей генов, предрасполагающих к раку молочной железы
3.3. Влияние перекиси водорода и стауроспорина на гибель моноцитов, особенности фрагментации ДНК в норме и при раке молочной железы
3.4. Влияние липидов на индуцированный перекисью водорода и стауроспорином апоптоз моноцитов
3.5. Моделирование методом молекулярной механики взаимодействий
липидов с ДНК
3.6. Влияние холестерола на экспрессию генов раннего ответа
Глава 4. Обсуждение
Выводы
Практические рекомендации
Список литературы


Заридзе Д. Г., . В тоже время до настоящего времени ряд вопросов, касающихся поведения моноцитов изучены недостаточно. В частности, показано, что в моноцитах усиливается липидный метаболизм, интенсифицируются процессы пероксидации липидов Щербаков В. И., . Зубова С. Г. и др. Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в изучении влияния липидов на индуцированный перекисью водорода и стауроспориномапоптоз моноцитов в норме и при раке молочной железы. Научная новизна работы. Впервые определены мутации в ключевых генах у жителей Республики Мордовия, предрасполагающие к раку молочной железы, оценена их частота. Новыми следует признать данные о том, что в выборке больных раком молочной железы наличие мутаций в гене 1 было выявлено в случаев. Безусловной новизной обладают сведения о том, что среди выявленных мутаций основную долю заняла мутация с1е1А . Впервые обнаружено, что доля мутации 5 составила и i , а мутация 2 в исследуемой выборке больных не выявлена. Изучены особенности фрагментации ДИК в норме и при раке молочной железы. Перекись водорода и стауроспории индуцируют апоптоз моноцитов у здоровых людей. У больных раком молочной железы ответ моноцитов на действие индукторов проявлялся, прежде всего, через склонность к гибели путем некроза. Впервые изучено влияние липидов сфингозина, фосфатидилхолина, холестерола на индуцированную перекисью водорода и стауроспорином гибель клеток. Наибольший проапоптотический эффект был выявлен при совместном действии индукторов апоптоза и сфингозина. У здоровых людей этот эффект обнаружен при действии сфингозина 0,1 и 0, ммольл и стауроспорина. У больных раком молочной железы высокий проапоптотический эффект моноцитов был обнаружен только при действии 0,1 ммольл сфингозина совместно с ммольл перекиси водорода иили стауроспорином. Впервые показано, что в моноцитах холестерол стимулирует экспрессию генов раннего ответа и р. Ключевыми мутациями клеток крови, предрасполагающими к раку молочной железы у жителей Республики Мордовия, являются мутации , I и i в гене 1, встречающиеся с частотами , и соответственно мутация в гене р с частотой генотипов , , ,5 , ,1 и ,5 соответственно. Перекись водорода и стауроспорин индуцируют апоптоз моноцитов у доноров, но при раке молочной железы приводят к гибели клеток, несущих мутации в ключевых генах 1, 2 и р, преимущественно путем некроза. Сфингозин и липосомы, содержащие фосфатидилхолин и холестерол, изменяют ответ моноцитов на действие индукторов апоптоза поразному в зависимости от их природы и концентрации. Ответ клеток на действие липидов и индукторов апоптоза имеет существенные различия у здоровых людей и больных раком молочной железы. Теоретическая и практическая значимость работы. Эта область исследований имеет не только теоретическую, но и практическую значимость. Оценка фрагментации ДНК может быть использована в качестве одного из основных критериев прогноза способности клеток к апоптозу при РМЖ. Влияние липидов на активность генетическиопосредованные процессы может быть связано с изменением генной экспрессии посредством взаимодействия липидов со специфическими последовательностями ДНК. Полученные данные по выявлению в клетках крови мутаций в ключевых генах ВКСА12, р могут быть использованы в медицине для уточнения диагноза онкозаболеваний, в частности рака молочной железы. Анробация работы. Материалы, представленные в диссертации, были доложены на международных научных конференциях Актуальные проблемы экологической физиологии, биохимии, генетики животных Саранск, , Диагностика, терапия, профилактика социально значимых заболеваний человека Турция, , на ежегодных Огаревских чтениях научных конференциях Мордовского госумиверситста Саранск, , , г. Ржавитинские чтения Саранск, , междунар. Е.В. Сапожниковой Саранск, , IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов Новосибирск, .