Клетки волосяного фолликула in vitro

• Автор: Чермных, Элина Сергеевна
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 170 с. : ил.

Введение. .

I. Обзор литературы.

1.1. Структура эпидермиса

1.1.1. Эпидермальная пролиферативная единица

1.1.2. Базальная мембрана

1.1.3. Цитокератины.

1.2. Клеточные контакты кератинецитов.

1.2.1. Плотные контакты

1.2.2. Заякоривающие контакты.

1.2.3. Коммуникационные контакты

1.3. Волосяной фолликул как производное кожи

1.4. Стволовая эпидермальная клетка.
1.4.1. Ниша стволовых клеток.
1.4.2. Характеристика стволовых клеток
1.4.3. Кератин положшпельные клетки
1.5. Мезенхимные клетки волосяного фолликула
1.6. Особенности культивирования клеток эпидермиса
1.6.1. Формирование культуры кератиноцитов
1.6.2. Адгезия кератиноцитов к субстрату
1.6.3. Действие различных субстратов и их использование при культивировании кератиноцитов.
1.6.4. Трансплантация выращенных с культуре эпидермальных пластов
1.6.5. Влияние факторов роста. .
1.6.6. Сохранение стволовых клеток в культуре.
1.6.7. Использование трехмерных гелей в культивировании эпителиальных клеток
1.7. Взаимодействие кератиноцитов и фибробластов
1.8. Морфогенез эпителия
1.8.1. Тубулогенез как пример морфогенеза
1.8.2. Механизм формирования тубулярных структур
.3. Влияние различных факторов на морфогенез
.4. Модель для изучения морфогенеза эпителиальных клеток
П. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
II. 1. МАТЕРИАЛЫ
.1.1. Клеточные культуры
П.1.2. Химические реактивы
II.2. МЕТОДЫ.
П.2.1. Выделение первичных кератиноцитов человека .
П.2.2. Культивирование кератиноцитов на пластике.
П.2.3. Получение базальных кератиноцитов.
П.2.4. Выделение клеток интерфолликулярного эпидермиса.
.2.5. Выделение и культивирование постнатальных фибробластов человека
.2.6. Выделение и культивирование эмбриональных фибробластов человека
.2.7. Выделение клеток дермальной папиллы человека.
.2.8. Выделение клеток ДП вибрисс крысы
П.2.9. Новый метод выделение клеток ДП
.2 Получение сред, кондиционированных фибробластами
П.2 Гистохимическое окрашивание
П.2 Индукция и детекция остео и адипогенной дифференцировок.
П.2 Выделение коллагена из хвостов крыс
.2 Обработка стекол субстратами
П.2 Обработка клеток митомицином С.
П.2 Приготовление коллагенового геля .
П.2 Иммуногистохимическое исследование.
.2 Культивирование кератиноцитов на поверхности коллагенового геля
.2 Культивирование кератиноцитов в коллагеновом геле.
П.2 Электронная микроскопия.
П.2 Меченые клеток лентивирусом.
.2 Трансплантация клеток иммунодефицитныммышам.
П.2 Выявление ВгеШмеченных клеток.
П.2 Выявление активности щелочной фосфатазы
.2 Изучение влияния различных факторов на поведение базальных кератиноцшпов .
.2 Статистическая обработка результатов
I. Результаты исследований.
III. 1. Стволовые клетки.
т. 1.1. Экспрессия кератина
III. 1.2. Влияние кальция на экспрессию кератина
1.1.3. Пролиферация Кклеток
1П.1.4. Экспрессия кератина в базальных кератиноцитах
Ш.1.5. Ингибирование пролиферации кератиноцитов митомицином С
Ш.1.6. Культивирование клеток интерфолликулярного эпидермиса.
Ш.2. Культивирование и характеристика клеток ДП
1.2.1. Разработка метода выделения клеток ДП
Ш.2.2. Культивирование клеток ДП.
III. 2.3. Идентификация клеток ДП
III. 2.4. Активность щелочной фосфатазы в клетках ДП.
Ш.2.5. Остео и адипогенная дифференцировки клеток ДП
1Л.2.6. Изучение индуктивных свойств клеток ДП.
ПТ.2.7. Индуктивные свойства иммортализованных клеток ДП.
1.2.8. индуктор морфогенеза
НТ.З. Структура эпидермальных выростов
Ш.3.1. Гистология тубулярных структур
1.3.2. Электронная микроскопия
1.3.3. Флуоресцентная микроскопия .
1.4. Способность кератиноцитов к самоорганизации
1.5. Изучение способности клеток встраиваться в трехмерные
структуры кожи i viv
III. 5.1. Трансдукция клеток лентивирусными частицами i vi
1П.5.2. Трансплантация клеток е систему i viv
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ЭПЕ эпидермальная пролиферативная единица
ФЭЧ фибробласты эмбриона человека
эпидермальный фактор роста i
фактор роста фибробластов i
фактор рассеивай и яфактор роста гепатоцитов
I инсулиноподобный фактор роста iii
. фактор роста кератиноцитов i
трансформирующий фактор роста i
фактор некроза опухолей i
I интерлейкин ii
I интерферон i
колон нестимулирующий фактор гранулоцитов и макрофагов ii
фактор роста нервов v
фактор роста из тромбоцитов iv
белок морфогенеза кости i i
среда Игла, модифицированная Дульбекко ii i этилендиаминтетрауксусная кислота iii i
фосфатносолевой буфер i
ПФА параформальдегид
I йодид пропидия ii ii
I 4,6диамидино2фснилиндол
ДП дермальная пап ил л а
БСА бычий сывороточный альбумин
ВгсШ бромдезоксиуридин
Введение


Каждая такая единица состоит из группы клеток, содержащих пролиферирующие и дифференцирурующиеся клетки. Пролиферирующие транзиторные клетки находятся в базальном слое, тогда как дифференцирующиеся клетки расположены в виде колонки шириной в одну клетку над пролиферирующими клетками. Число базальных клеток в ЭГ1Е в среднем составляет , но может быть и значительно меньше или существенно больше. Только этих клеток способны к пролиферации. Из оставшихся клеток одна является клеткой Лангерганса, а , повидимому, являются постмитотическими клетками и ожидают сигнала для миграции в вышележащие слои эпидермиса. Принципиально важным в гипотезе Поттена является представление о том, что в центре ЭПЕ в базальном слое находится стволовая клетка , . Согласно Потгену все клетки ЭПЕ берут начало от стволовой клетки, однако иммунологическое изучение химерного эпидермиса мыши дает основание считать, что некоторые клетки ЭПЕ могут быть потомками клеток, мигрировавших сюда из соседних ЭПЕ i . Камеда и соавторы предложили новую модель, по которой одна стволовая клетка снабжает 6 пролиферативных единиц . Рисунок 1. Схематическое изображение эпидермальной пролиферативной единицы по , , с изменениями. В эпидермисе человека строение ЭПЕ изучено слабо. В коже человека не удается морфологически различить ЭПЕ, подобные тем, что найдены в коже мыши, так как в морфологии эпидермиса человека и мыши существуют значительные различия. Эпидермис кожи спины у мышей относительно плоский и имеет только 2 слоя клеток, в то время как эпидермис человека состоит из множества слоев до , и, хотя его поверхность плоская, базальный слой имеет неровную, бугристую структуру. Участки эпидермиса, уходящие в дерму, называют гребнями, тогда как участки дермы, вдающиеся в слой эпидермиса, дермальными сосочками . ЭПЕ в базальном слое располагается стволовая клетка. После ранения структура эпидермиса радикально меняется. ЭПЕ в ране не обнаруживаются. Колодка и соавторы . ЭПЕ имели вид вертикальных клеточных колонок. Эти данные показывают, что организация эпидермиса в виде ЭПЕ восстанавливается после его ранения. ЭПЕ в культуре эпидермальных кератиноцитов формируется путем самоорганизации образующихся в процессе деления клеток , . Однако клеточные механизмы самоорганизации изучены слабо. Пространственная организация эпидермиса определяется наличием базальной мембраны. Базальная мембрана это эластичная, тонкая пластинка, состоящая из внеклеточного матрикса, которая располагается на границе эпидермиса и дермы. Базальная мембрана выполняет не только структурную роль. Базальная мембрана почти полностью синтезируется за счет располагающихся на ней клеток. В коже базальная мембрана прикрепляется к лежащей под ней соединительной ткани за счет заякориваюших фибрилл, состоящих из молекул коллагена VII типа. Основными компонентами базальной мембраны являются коллаген IV типа, протеогликан перлекан, состоящий из молекул гепаран сульфата, а также гликопротсины, такие как ламинин и нидоген. Коллаген IV типа существует в нескольких изоформах. Все они обладают большей эластичностью, чем фибриллярные коллагены. В раннем развитии базальная мембрана содержит мало коллагена IV типа или не содержит вовсе, и состоит, главным образом, из молекул ламинина. Как и другие белки во внеклеточном матриксе, ламинин имеет несколько функциональных доменов один связывается с перлеканом, другой с нндогеном и несколько с рецепторами ламинина на поверхности клеток. Многие из рецепторов клеточной поверхности к коллагену IV типа и ламинину относятся к семейству интегринов. Другой важный тип рецептора ламинина трансмембранный белок дистрогликан, который совместно с интегринами играет ключевую роль в организации базальной мембраны . Базальная мембрана может служить барьером для передвижения клеток, не давая фибробластам контактировать с эпителиальными клетками. Базальная мембрана играет важную роль в регенерации ткани после повреждения. В то время как эпителиальные клетки погибают, она остается целой и обеспечивает матрикс, по которому могут мигрировать регенерирующие клетки.