Введение гена каталитического компонента теломеразы (hTERT) в клетки с различным дифференцировочным потенциалом

• Автор: Дашинимаев, Эрдэм Баирович
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 119 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Культуры клеток.

1.1 Мезенхимальные стромальныс клетки костного мозга человека, культура XI.

1.2 Клетки стромы губчатой кости человека, культура .

1.3 Мезенхимальные стромальныс клетки жировой ткани человека, культура .

1.4 Фетальные нейральные стволовые клетки человека, культура

1.5 Клетки линии ТК

2. Введение гена каталитического компонента теломеразы при помощи лентивирусного вектора

3. Дифферснцнровка клеток и методы регистрации

3.1 Дифферснцнровка в адипогенном направлении и специфическое окрашивание.

3.2 Дифференциовка в остеогенном направлении и специфическое окрашивание.
3.3 Иммуноцитохимия.
3.4 Выявление белкового компонента теломеразы i i
3.5 Доверительные интервалы погрешности
4. Изучение кариотнпа.
4.1 Приготовление хромосомных препаратов из митотических клеток человека
4.2 Дифференциальное окрашивание хромосом.
5. Определение экспрессии генов методом ОТПЦР
5.1 Выделение РНК
5.2 Реакция обратной транскрипции и ПЦР.
5.3 Использованные в работе праймеры
6. Определение тсломеразной активности
6.1 Приготовление клеточного экстракта
6.2 Реакция и электрофорез
7. Флуоресцентная гибридизация i i I теломерного повтора на хромосомах человека
8. Тес на наличие контактного торможении пролиферации и реакции на сывороточное голодание.
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Введение гена в мезенхимальные стволовые клетки МСК человека, полученные из различных типов ткапей и исследование их дифференцнровочного потенциала.
1.1 Стромальные клетки костного мозга человека, культуры XI и Xi
1.2 Клетки стромы губчатой кости человека, культуры и i.
1.3 Стромальные клетки жировой ткани человека, культуры и i
1.4 Тест на наличие контактного торможения и реакцию на сывороточное голодание, клеток i.
2. Введение гена в нейральные стволовые клетки человека ИСК и исследование свойств полученной линии
2.1 Клетки и i.
2.2 Иммуногистохимическое исследование экспрессии маркеров дифференцировки.
2.3 Определение экспрессии маркеров дифференцировки методом ОТГТЦР.
2.4 Нсйросферы, полученные из и i
2.5 Образование колоний разной морфологии.
2.6 Кариотнпированне культуры i.
2.7 Определение теломеразной активности методом .
2.8 Качественный анализ величины теломер клеток 4i.
2.9 Определение теломеразной активности имму ногистох им и чески м методом.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
1. Образование иммортализованных культур стволовых клеток т i при помощи введения гена каталитического компонента теломеразы человека.
2. Сохранение механизмов днфференцировки в иммортализованных культурах клеток.
3. Сохранение теломеразной активности
4. Стабильность кариотипа, сохранение способностей к контактному торможению и сохранение способности к переходу в пролиферативный покой в условиях сывороточного голодания.
ВЫВОДЫ.
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Определение экспрессии маркеров дифференцировки методом ОТГТЦР. Образование колоний разной морфологии. Кариотнпированне культуры i. Определение теломеразной активности методом . Качественный анализ величины теломер клеток 4i. Определение теломеразной активности имму ногистох им и чески м методом. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ. Образование иммортализованных культур стволовых клеток т i при помощи введения гена каталитического компонента теломеразы человека. Сохранение механизмов днфференцировки в иммортализованных культурах клеток. Стабильность кариотипа, сохранение способностей к контактному торможению и сохранение способности к переходу в пролиферативный покой в условиях сывороточного голодания. ВЫВОДЫ. ОТПЦР метод обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции. СКЖТ стволовые клетки жировой ткани. ССФ стромальнососудистая фракция ТАК теломеразная активность ЭСК эмбриональные стволовые клетки УН удвоения популяции. В настоящее время одним из самых перспективных и развивающихся направлений в медицине являются клеточнозамещающие технологии клеточные трансплантации и тканевая инженерия. Эти технологии применяются для лечения заболеваний связанных с повреждением или дегенерацией различных типов тканей, например ожоги, инсульты, ишемии, травмы спинного мозга, нейродегенеративные болезни синдромы Альцгеймера и болезнь Паркинсона. Предполагается, что в качестве замещающего материала наиболее оптимальным будет использование стволовых клеток, то есть клеток способных дифференцироваться в клетки различных типов тканей. Во избежание иммунных конфликтов для подобного рода трансплантаций наиболее целесообразно использовать аутологичные стволовые клетки человека. Поэтому в настоящий момент во всем мире проводится очень много исследований, связанных с поиском способов получения, культивирования и наращивания аутологичного донорского клеточного материала i vi, изучением механизмов дифференцировки, способов создания специфичных тканевых трансплантатов для их дальнейшего использования в медицине. Одной из главных проблем, связанных с культивированием стволовых клеток i vi является то, что практически все первичные культуры клеток, получаемые из тканей взрослого человека имеют ограниченный пролиферативный потенциал и быстро теряют способность к дифференцировке. Полученные при этом теломеризованные клетки, как правило, сохраняют нормальные механизмы регуляции пролиферации. Цель настоящей работы заключалась в исследовании возможности получения иммортализованных линий стволовых клеток при помощи введения гена каталитического компонента теломеразы и проследить каким образом может влиять экспрессия гена ИТЕЯТ на способности теломеризованных клеток к дифференцировке. С начала XX пека в биологии доминировало мнение, что клетки многоклеточных организмов иммортальны, то есть способны к бесконечно долгой пролиферации. Этому способствовали успешные работы, авторы которых доказывали бессмертие клеток, культивируя их в течении долгого периода времени. Например, Каррель и его сотрудники , культивировали фибробласты из сердца куриного эмбриона в течение лет. Клетки асцитной опухоли культивировали в перитонеальных полостях крыс в течение многих лет Вильсон, . Однако, наряду с такими успешными опытами, появлялось все больше и больше работ, сделанных в основном на клетках человека, авторы которых наблюдали плавное угасание пролиферации клеток в культуре. В г. Хейфлик опубликовал результаты своих многолетних наблюдений, указывавшие на закономерности ограничения пролиферации в его опытах i , . Оказалось, что культуры диплоидных фибробластов человека ДФЧ способны расти только более или менее определенное количество пересевов, порядка , после чего клетки дегенерируют. Жизнь клеток в культуре была разделена Хейфликом на три фазы рис. I представляет собой становление популяции i vi, фаза II период последовательных пассажей и экспоненциального роста числа клеток, фаза III фаза истощения пролиферативного потенциала. Длительность фазы I это время, необходимое для образования первого сомкнутого монослоя, т.