Белок Р70, связывающий сателлитную ДНК in vitro: характеристика и локализация

• Автор: Енукашвили, Нателла Иосифовна
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 119 с.

1. ВВЕДЕНИЕ

1.1. Цели и задачи исследования.

1.2. Основные положения, выносимые на защиту

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

2.1. Тандемно организованные высокоповторяющисся последовательности сателлитные ДНК человека и мыши

2.1.1. История открытия

2.1.2. Сателлитные ДНК человека

2.1.2.1. СатДНКс простой последовательностью сателлиты 1, 2 и 3.

2.1.2.2. Альфоидная ДНК

2.1.3. Сателлитные ДНК домовой мыши .

2.2. Организация и функции центромера и кинетохора млекопитающих.

2.3. Центромерные белки высших эукариот
2.3.1. Конститутивные центромерные белки.
2.3.2. Транзитные центромерные белки.
2.4. Концепция ядерного матрикса
2.5. Современные представления о функциях избыточной ДНК.
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
3.1.Биохимические методы.
3.1.1.Плазмид ы
3.1.2.Выделение ядер и ядерного матрикса экстракция белков ЯМ.
ЗЛ.З.Ионообменная хроматография
3.1.4. Метод замедления в геле ретардации
3.1.5. Аффинная очистка ДНКсвязывающих белков ядерного матрикса
3.1.6. Дискэлектрофорез и окрашивание гелей.
3.2. Иммунологические методы.
3.2.1. Иммуноблотгинг
3.2.2. Получение антител иммунизация и аффинная очистка.
3.2.3. Иммунопреципитация
3.3. Цитологические методы.
3.3.1. Использованные объекты
3.3.2. Непрямое иммунофлюоресцентное окрашивание.
3.3.3. Флуоресцентная гибридизация i i III и иммуноПБН.
4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
4.1. Выявление ДИКсвязывающей активности в препаратах ЯМ человека
4.2. Специфичность связывания альфоидной ДНК с белками ЯМ человека
4.3. Выявление ДНКсвязывающей активности в препаратах ЯМ мыши
4.4. Аффинная хроматография белков, входящих в состав и НМР.
4.5. Получение антител к белкам и НМР комплексов
4.6. р в составе ядерного матрикса мыши.
4.7. Определение молекулярной массы белков, взаимодействующих
с альфоидной ДИК, методом Саузвестсрнбло пинга.
4. 8. Получение аффинно очищенных антител к белку р.
4.9. Сравнение р с известными белками матрикса и группы
4.9.1. Сравнение белка р с белками группы
4.9.2. Выявление в р общей антигенной детерминанты с белками ПФ
4.9.4. Сравнение р с белком, связывающим сателлит 3 человека
4 Локализация р в ядрах клеток человека и мыши
Определение положения р по отношению
к гетерохроматину.
. Определение взаимного расположения р и ламннов
. Определение положения асателлитной ДНК и
сателлита 3 3 в клетках линий человека
. Определение положения р по отношению к альфоидной ДНК
и ДНК сателлита 3 в клетках линий А1 человека.
. Определение положения р по отношению к центромеру
в клетках линии ЗТЗ мыши
4 Локализация р на ме гафазных хромосомах мыши и человека.
5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
6. ВЫВОДЫ.
7. СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ


Мы предположили, что среди белков ЯМ присутствуют белки, способные распознавать сатДНК центромерных участков и прицентромерных участков хромосом. Взаимодействие центромерной и прицентромерной сателлитной ДНК с белками ЯМ должно быть необходимо для функционирования центромера в интерфазный период. Поиски таких белков до сих пор приводили к неоднозначным результатам. ДНК. Однако не было выявлено ни определенной последовательности, ни сиквенсспецифического белка, которые необходимы и достаточны для выполнения функций центромера. Наиболее часто используемый подход выявление центромерлокализованных белков с помощью сыворотки аутоиммунных больных и последующее изучение этих белков, имеет свои ограничения. В настоящей работе использован другой подход для поиска белков, взаимодействующих с сатДНК. Изучение способности белков ЯМ взаимодействовать с сатДНК центромерных районов хромосом проводили с помощью метода ретардации в геле и, таким образом, подтвердили предположение о специфическом взаимодействии белков ЯМ с центромерными сатДНК i vi. Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлся поиск белков ядерного матрикса, специфически взаимодействующих с сатДНК центромерных и приценгромериых участков хромосом человека и мыши. Показать способность ядерного матрикса человека и мыши связывать центромерные и прицентромерные сателлитные ДНК в условиях i vi. Оценить специфичность взаимодействия белков ядерного матрикса с сателлитными ДНК i vi. Получить антитела к выявленным ДНКбелковым комплексам. Идентифицировать белок или белки, связывающие сатДНК i vi. Исследовать внутриклеточную локализацию белка, связывающего сатДНК. Ядерный матрикс человека содержит белковый комплекс, специфически связывающий сатДНК i vi. Белок р кДа является мажорным ДНКсвязывающим белком данного комплекса. Р не являегся уже известным белком из 1руппы и не относится к ламинам. Р обладает обшей антигенной дегерминантой с белками промежуточных филаментов. Р является белком описанным ранее, как связывающий сателлит 3 человека II3 и, вероятно, сатДНК птиц. Локализация р различна в клетках различной степени дифференцированное, с разной транскрипционной активностью. В большинстве интерфазных клеток НеЬа белок р присутствует в составе 5С доменов. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. Геном человека, как и других эукариотных организмов содержит значительное количество элементов, представленных более чем одной копией. Повторяющиеся последовательности составляют до генома эукариот i, . Эти последовательности могут быть разделены на две группы рассеяные но геному, или диспергированные повтори i и тандемно организованные высокоповторяющиеся сателлитные ДНК Рассеянные повторы часто представляют собой неактивные копии элементов ретранспозонового типа. Тандемно организованные высокоповторяющиеся последовательности сателлитные ДНК человека и мыши. Сателлитная ДНК сатДНК впервые обнаружена Китом в г. ДНК, выявляемая при равновесном центрифугировании в градиенте хлористого цезия. Использование при равновесном центрифугировании ДНКинтеркалирующих красителей и солей тяжелых металлов ртути или серебра позволило увеличить разрешающую способность данного метода и обнаружить сатДНК у большинства видов эукариот Беридзе, . Исследования по кинетике реассоциации ДНК показали, что сатДНК содержат высокоповторяющиеся последовательности i, , , , , , которые составляют до нескольких десятков процентов от всей ядерной ДНК эукариот. В работе , доказавших центромерную локализацию мажорного сателлита мыши, впервые было показана локализация определенною типа сатДНК в цитологически различимых хромосомных доменах. Использование метода равновесного центрифугирования в храдиентс хлористого цезия геномной ДНК человека и последующее клонирование позволил выявить так V называемые сателлиты с простой последовательностью i i, мономерные единицы которых имеют длину 5 нуклеотидов . Использование эндонуклеаз рестрикции позволило выявить и другие семейства сатДНК. С помощью рестриктаз I и X были обнаружены субсемейства альфоидной асателлитной ДНК ii, , .