Изучение механизмов спонтанных реверсий злокачественных клеток к неопухолеродному фенотипу

• Автор: Ефремов, Ярослав Рейнгольдович
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 105 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Трансформация клеток и приобретение ими опухолевого фенотипа.

1.1.1. Молекулярные аспекты иммортализацииГ

1.1.2. Контактное торможение.

1.1.3. Рост в неприкрепленном состоянии, анойкис.

1.2. Реверсия опухолеродных клеток к неопухолеродному фенотипу.

1.2.1. Индуцированные реверсии.

1.2.2. Спонтанные реверсии .

1.2.3. Спонтанные реверсии как источник дремлющих метастазов.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Клеточные линии и культуры
2.1.1. Оценка роста клеток в сингенных животных
2.1.2. Оценка контактного торможения клеток по включению 3Нтимидина.
2.1.3. Оценка способности клеток к росту в неприкрепленном состоянии.
2.2. Выделение суммарной РЖ из клеток.
2.3. ДПКазная обработка и анализ выделенной РНК
2.4. Обратная транскрипция.
2.5. Определение относительных концентраций полученной кДПК методом полуколичественного ПЦР
2.6. Сравнение уровней экспрессии исследованных генов в различных клетках методом полуколичественного ПЦР
2.7. Математическая обработка полученных данных
2.8. Проточная цитофлюорометрия.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Сравнение ростовых характеристик злокачественных и ревертантных линий и клонов i vi и i viv
3.1.1. Оценка опухолеродности клеток по росту опухолей в сингенных животных.
3.1.2. Оценка опухолеродности клеток по основным параметрам роста i vi.
3.2. Сравнение уровней мРНК различных ростовых факторов и их рецепторов в злокачественных и ревертантных линиях и клонах i vi и i viv
3.2.1. Оценка уровней синтеза мРНК основных ростовых факторов клетками i vi
3.2.2. Оценка уровней синтеза мРНК рецепторов ростовых факторов клетками i vi и i viv.
3.2.3. Оценка уровней синтеза мРНК Гепатоцитарного Ростового Фактора
опухолевыми и псевдонормальными клетками i vi и i viv.
3.3. Сравнение злокачественных и псевдонормальных клеток по содержанию белковых продуктов исследованных генов
3.3.1. Сравнение опухолевых и псевдонормальных клеток, находящихся в логарифмической фазе роста, по содержанию белковых продуктов , и

3.3.2. Сравнение количества белкового продукта в псевдонормальных клетках, находящихся в логарифмической фазе роста и в , обусловленной контактным торможением конфлюэнтные клетки.
0 3.4. Реакция клеток на , и АА.
3.4.1. Эффективность спасения клеток от апоптоза в присутствии , и АА
3.4.2. Влияние антител против рецептора на пролиферацию и апоптоз клеток
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Спонтанные реверсии как источник дремлющих метастазов. ГЛАВА 2. Оценка контактного торможения клеток по включению 3Нтимидина. Оценка способности клеток к росту в неприкрепленном состоянии. Выделение суммарной РЖ из клеток. Обратная транскрипция. Проточная цитофлюорометрия. ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. Оценка опухолеродности клеток по росту опухолей в сингенных животных. Оценка опухолеродности клеток по основным параметрам роста i vi. Оценка уровней синтеза мРНК рецепторов ростовых факторов клетками i vi и i viv. Сравнение количества белкового продукта в псевдонормальных клетках, находящихся в логарифмической фазе роста и в , обусловленной контактным торможением конфлюэнтные клетки. Реакция клеток на , и АА. ВЫВОДЫ. СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ. Актуальность исследования. Одной из наиболее серьезных проблем клинической онкологии является метастазирование опухолей и, особенно, молчащее метастазирование. Указанные проблемы являются следствием того, что метастазировавшие клетки очень долгое время способны находиться в состоянии покоя . Однако, более поздние трактовки данной теории говорят о том, что злокачественность является количественным признаком и, соответственно, клетки могут не только прогрессировать по данному признаку, но и самопроизвольно возвращаться
ревертировать к исходному фенотипу. Более того, было показано, что
спонтанные реверсии являются скорее результатом эпигенетических изменений, чем изменений па уровне генома. В пользу данного утверждения свидетельствуют высокие в некоторых случаях до , не сопоставимые с мутационными, частоты появления таких рсвертантов. Реверсия злокачественных клеток к неопухолевому фенотипу сопровождается, восстановлением основных механизмов, регулирующих пролиферацию нормальных клеток, таких как контактное торможение, зависимость от ростовых факторов и внеклеточного матрикса, апоптоз. Поэтому, в случае ревертантов говорят не о нормальном, а о псевдонормальном фенотипе. Таким образом, источником дремлющих метастазов, повидимому, являются опухолевые клетки, временно ревертировавшие к псевдонормальному фенотипу. На данный момент времени практически ничего не известно о механизмах таких реверсий, и исследования в этой области могут дать ключ не только к пониманию неких фундаментальных законов клеточной биологии, но и дать толчок к развитию новых методов прогнозирования, диагностики и эффективной терапии молчащих метастазов. Цель и задачи исследования. Научная новизна. Теоретическая значимость. Выявлены эпигенетические изменения, сопровождающие процесс реверсии опухолевых клеток фибробластичсского происхождения к псевдонормальному фенотипу. Практическая значимость. Полученные результаты могут быть использованы для разработки методов прогнозирования, ранней диагностики, а возможно и эффективной терапии молчащих метастазов. ГЛАВА 1. Процесс превращения нормальной клетки в злокачественную или, иными словами, в трансформированную носит выраженный ступенчатый характер. На первом этапе нормальная клетка должна стать иммортализованной или бессмертной. Известно, что нормальные клетки отличаются от трансформированных тем, что не могут делиться бесконечно. Такое ограничение на количество доступных циклов деления зависит от типа клеток и их видового происхождения, и впервые было показано Хейфликом в экспериментах по культивированию диплоидных человеческих фибробластов i vi в году i, , . По достижении предела возможных делений предел Хейфлика клетки, независимо от наличия в культуральной среде необходимых для пролиферации белковых факторов роста и компонентов внеклеточного матрикса, перестают делиться и постепенно погибают. Однако было показано, что клетки могут преодолевать указанный предел Хейфлика, приобретая способность делиться вечно i . Этот процесс называется иммортапизацией. Искусственно клетки можно иммортализовать трансформацией различными вирусными онкогенами, такими, например, как Е6Е7 гены V, большой Т антиген V, Е1А, вирус ЭпштейнБарр, V, vi iii, v, v, v . II , , , а также мутантным , .