Функция SH3-домена фосфолипазы C гамма 1

• Автор: Творогов, Денис Борисович
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 110 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Фосфолипаза С гамма 1, е структура и свойства

2.2. Структура рецептора ЭФР.

2.3. Активация рецептора ЭФР и основные пути

передачи сигнала с активированного рецептора

2.4. Рецепторопосредованный эндоцитоз.

2.5. Регуляция активности ФЛСу 1.

2.6. Роль ФЛСу1 в различных
внутриклеточных процессах.
2.7. Белок сСЫ, структура и функция.
2.8. Общие механизмы убиквитинилирования белков
2.9. Роль белка сСЫ в негативной регуляции
сигнача запускаемого факторами роста
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
3.1. Клеточные линии и их культивирование
3.2. Антитела
3.3 Иммунопреципитация, электрофорез и иммуноблоттинг
3.4. Получение вБТрекомбинантных белков.
3.5. Преципитация и блоттинг с
помощью СБТрскомбинантных белков.
3.6. Получение клеточных линий, стабильно экспрессирующих различные формы ФЛСу 1.
3.7. Регистрация выхода ионов
кальция из внутриклеточных депо
3.8. Прижизненная микроскопия
с использованием зеленого белка
3.9. Субклеточное фракционирование
в градиенте плотности Перколла.
3 Иммунофлуоресцентнос окрашивание клеток
4. РЕЗУЛЬТАТЫ.
4.1. Ассоциация с эндосомами
4.2. Идентификация белков, взаимодействующих
с 3 доменом ФЛСу1 i vi.
4.3. Выявление ассоциации белка сСЫ и ФЛСу1 i viv Получение и характеристика линий со стабильной
экспрессией различных форм ФЛСу1.
4.4. Влияние делеции 3 домена на ассоциацию ФЛСу
с активированным рецептором ЭФР и белком сСЫ
4.6. Для ассоциации ФЛСу1 и белка сСЫ
необходимо фосфорилирование обоих белков.
4.7. Влияние делеции 3 домена ФЛСу1 на выход ионов кальция
из внутриклеточных источников последействия ЭФР
5. ОБСУЖДЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Ферменты семейства фосфолипаз С катализируют гидролиз фосфоинозитид4,5бисфосфата ФИФ2 с образованием двух продуктов инозитид1,4,5трифосфата ИФ3 и диацилглицерола ДАГ Первый вызывает выход кальция из внутриклеточных источников, а второй активацию белков семейства протеинкиназ С. Таким образом, ФЛСу1 участвует в регуляции сразу очень многих процессов, которые зависят от концентрации ионов кальция, от серинтреонинового фосфорилирования, осуществляемого протеин киназами С, а также от концентрации фосфоинозитид4. Семейство фосфолипаз С включает фосфолипазы Ср ФЛСР14, фосфолипазы С5 ФЛС4 и фосфолипазы Су ФЛСу1,2. Действие различных внеклеточных стимулов приводит к активации различных типов фосфолипаз С. Семейство фосфолипаз Су вовлечено в проведение внутриклеточных сигналов запускаемых факторами роста. Отличительной особенностью ФЛСу является наличие двух 8Н2 и одного доменов. Данная особенность существенно сказывается на свойствах этого типа фосфолипаз С и в наибольшей степени определяет их роль в проведении внутриклеточного сигнала. У. БН2 домены определяют взаимодействие с активированными рецепторами факторов роста, такими как рецептор эпидермального фактора роста ЭФРР или рецептором фактора роста выделяемого тромбоцитами ФРВТР. Ассоциация ФЛСу с активированным рецептором ЭФР приводит к е фосфорилированию активированной тирозинкиназой рецептора ЭФР Медведева, . Па сегодняшний день считается, что фосфорилирование но тирозину является основным событием, активирующим ферментативную активность ФЛСу. Далее активированная ФЛСу катализирует гидролиз ФИФ2 с образованием ИФ3 и ДАГ. Несмотря на кажущуюся ясность механизмов активации ФЛСу, остатся множество нерешенных вопросов и противоречивых литерату рных данных. Показано например, что экспрессированые в виде отдельных полипептидов X и У домены ФЛСу не только образуют комплексы друг с другом, но и обладают ферментативной активностью в 0 раз большей чем фермент дикого типа Ногетап е а. Показано также, что выделенная из нестимулированных клеток, не фосфорилированная ФЛСу обладает достаточной ферментативной активностью для обеспечения фосфоинозитидного обмена в клетке. В литературе высказываются предположения, что последовательность, содержащая 8Н2 и 8НЗ домены, шрает важную роль в регуляции активности ФЛСу. Например, показано что разрушение 8Н28НЗ последовательностей приводит к увеличению активности ФЛСу Ретак В то время как роль 8Н2 домена обеспечивающего ассоциацию ФЛСу с активированными рецепторами факторов роста достаточно хорошо изучена, роль 8НЗ домена в составе ФЛСу остатся неизвестной. Показано, что i vi наибольшим сродством к 3 домену ФЛСу1 обладает последовательность V . Однако, в литературе фактически отсутствуют данные о функции I3 домена ФЛСу1, выполняемой i viv. Так например, было показано что изолированный 3 домен ФЛСу1 i vi связывается с динамином, однако, i viv это взаимодействие оказалось значительно слабее, и его функциональное значение до сих пор не ясно i . Эксперименты с микроинъекцией энзиматически не активной ФЛСу1 показали, что в клетках I33 после микроинъекции наблюдалось кратное увеличение синтеза ДНК i . Микроинъекция пептидов, состоящих из 2 и 3 доменов ФЛСу1, также приводит к увеличению синтеза ДНК . Причем наличие 3 домена для активации синтеза ДНК было необходимо поскольку пептиды, содержащие только II2 домены, вызывали синтез ДНК в значительно меньшей степени. На основании этих данных было высказано предположение о том, что ФЛСу1 имеет ряд дополнительных функций, отличных от е ферментативной активности. В последнее время появились новые данные о функциональной роли 3 доменов других белков, участвующих в передаче сигнала, запускаемого ЭФР. Показано что р субъединица фосфатидилинозитол3киназы ФИЗК с помощью 3 домена, входящего в е структуру, ассоциируется с белком , который является убиквитинлигазой ЕЗ . Данное взаимодействие приводит к полиубиквитинилированию ФИЗК и се последующей протеосомной деградации. Следует отметить что ФИЗК, как и ФЛСу1, является одним из ферментов фосфоинозитидного обмена активируемого действием ЭФР.