Механизмы антипролиферативного действия ингибиторов деацетилаз гистонов на эмбриональные стволовые клетки мыши

• Автор: Чуйкин, Илья Александрович
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 139 с. : ил.

1.1 Актуальность проблемы

1.2 Цели и задачи исследования.

ГЛАВА 2. Обзор литературы.

2.1 Эмбриональные стволовые клетки мыши, происхождение, способы получения. Тератокарциномы.

2.2 Транскрипционные факторы, маркеры мЭСК

2.2.1 4.
2.2.2 x
2.2.3 x3.
2.2.4 .

2.2.5 Влияние и 4 на транскрипцию, роль белков группы

2.3 Сигнальные пути, участвующие в поддержании недифференцированного состояния ЭСК мыши
2.3.1 I3 путь
2.3.2 сигнальный путь
2.3.3 зависимые пути.
2.3.4 Ркиназный путь.
2.3.5 Путь через киназу
2.4 Особенности регуляции клеточного цикла мЭСК.
2.5 Вклад структуры хроматина в поддержании высокопролиферативного статуса мЭСК.
2.6 Структура сигналыюго пути позвоночных. Роль ркатенина в адгезии клеток и регуляции транскрипции
2.7 Нарушение регуляции сигнального пути при канцерогенезе. Роль пути в регуляции функций стволовых клеток
2.8 Роль сигнального пути в диффереицировкс клеток
2.9 Баланс клеточной адгезии и сигналинга. Эпителиальномезенхимальный переход ЭМП.
2. Транскрипционный фактор АР1 участник ЭМП и дифференцировки клеток
Состав димеров АР1 и консенсусные последовательности
Партнеры АР1 по образованию комплексов с элементами ДНК. Изменение консенсусных последовательностей АР1 фактора. .
Гены раннего ответа и и их регуляция на уровне транскрипции и посттрансляционных модификаций, структура регуляторных областей генов и с, .
Участие транскрипционного фактора АР1 в дифференцировке клеток
2. Роль 5катенина в сохранении плюрипотентности и дифференцировке мЭСК
ГЛАВА 3. Материал и методика
3.1 Культивирование клеток
3.2 МТТтест
3.3 Анализ активности каспаз в клеточных экстрактах.
3.4 Однопараметрический анализ распределения клеток методом проточной цито.метрии.
3.4.1 Мечение для оценки интенсивности пролиферации.
3.5 Анализ активации транскрипции репортерной плазмиды
3.6 Выявление активности в клетках.
3.7 Изучение локализации белков методом иммунофлюоресценции.
3.8 Выявление олигонуклсосомной фрагментации ДНК
3.9 Всстернблотинг.
3. Анализ киназной активности i vi
3. Анализ транскрипции генов методом .
ГЛАВА 4. Результаты.
4.1 Влияние ингибиторов деацетилаз гистонов на пролиферацию и выживание мЭСК
4.1.1 Скорость прироста популяции и клоногенная выживаемость мЭСК.
4.1.2 Распределение мЭСК по фазам клеточного цикла
4.1.3 Индукция клеточной гибели после воздействия ингибиторов
4.1.4 Активация каспаз в мЭСК после воздействия ингибиторов
4.1.5 Замедление пролиферации мЭСК после воздействия подтверждается с помощью мечения
4.1.6 Подавление Е2Рзависимой транскрипции в мЭСК после обработки ингибиторами
4.1.7 Экспрессия генов, кодирующих регуляторы клеточный цикл после воздействия ингибиторов
4.1.8 Обработка мЭСК не вызывает индукции ускоренного клеточного старения и транскрипции гена ршк4а.
4.2. Внутриклеточная локализация катенина, Е и кадгеринов и актина в
недифференцированных мЭСК.
4.3 Признаки эпителиальномезенхимального перехода, наблюдаемые при дифференцировке.
4.3.1 Активность транскрипционного фактора АР1 увеличивается в ходе дифференцировки клеток эмбриональной карциномы мыши линии
4.3.2 Уровень транскрипции генов и увеличивается в ходе дифференцировки клеток 9.
4.3.3 В недифференцированных клетках 9 транскрипция гена находится под негативной регуляцией деацетилаз гистонов.
4.3.4 Диффсренцировка мЭСК сопровождается экспрессией генов и проявлением морфологических признаков эпителиальномезенхимального перехода.
4.3.5 Воздействие не вызывает признаков ЭМП в мЭСК
ГЛАВА 5. Обсуждение результатов.
5.1 Влияние ингибиторов на клеточный цикл мЭСК.
5.2 Влияние ингибиторов на жизнеспособность мЭСК
5.3. Признаки дифференцировки и ускоренного клеточного старения после воздействия ингибиторов .
5.4. Признаки эпителиальномезенхимального перехода ЭМП при дифференцировке клеток эмбриональной карциномы и эмбриональных стволовых клеток мыши.
5.4.1. Активность транскрипционного фактора АР1 увеличивается при дифференцировке клеток эмбриональной карциномы мыши линии 9.
5.4. Локализация катенина в быстроделящихся недифференцированных мЭСК
5.5. Необходимость сигнального пути для реализации ЭМП в ранних эмбриональных клетках
ГЛАВА 6. Заключение
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Используя ингибиторы гистондеацетилазной активности, изучить зависимые от структуры хроматина механизмы регуляции клеточного цикла и пролиферации мЭСК i vi. Исследовать внутриклеточную локализацию белков межклеточной адгезии и изменения активности сигнального пути при действии ингибиторов и при дифферснцировке мЭСК. Ркатенина, Екадгерина и Ыкадгерина. ГЛАВА 2. Эмбриональные стволовые клетки мыши, происхождение, способы получения. Тератокарциномы. Линии эмбриональных стволовых клеток мыши мЭСК получают из эмбрионов на стадии бластоцисты . На этой стадии эмбрион состоит из внутренней клеточной массы ВКМ, находящейся на одной стороне полости, окруженной клетками трофобласта. Изолированные ВКМ помешают на подложку из эмбриональных фибробластов мыши, обработанных агентом, блокирующим их деление митомицин С. Клетки подложки служат для мЭСК субстратом и секрстируют необходимые факторы. В дальнейшем мЭСК могут культивироваться на подложке фибробластов или на желатинизированных чашках Петри в среде, щ, содержащей необходимые регуляторные факторы , , . Способность дифференцироваться в производные трех зародышевых листков называется плюрипотентностью, которая являегся важнейшим свойством мЭСК, лежит в основе создания химерных мышей и изучения функций генов i viv v . В настоящее время разработаны условия для разных типов дифференцировок i vi. Кроме того, потенциал к дифференцировке проявляется при пересадке мЭСК, экспрессирующих зеленый флюоресцентный белок, в бластоцисту. Потомки пересаженных клеток, содержащие флюоресцентную метку, детектируются в тканях производных трех зародышевых листков. Еще одним тестом на илюрипотентность является способноегь мЭСК образовывать тератомы при введении под кожу мышам. Тем не менее, тот факт, что линии мЭСК получают из ВКМ, не означает, что мЭСК и ВКМ полностью идентичны. В ходе эмбриогенеза стадия ВКМ существует короткое время и не является надклеточной структурой, в которой стволовые клетки сохраняются длительной время. Таким образом, не очевидно, что клетки, подобные мЭСК существуют i viv, скорее, это клетки ВКМ, прошедшие селекцию к условиям культивирования, но сохранившие плюрипотентность. Отличительной чертой мЭСК являегся их иммортальность, т. Однако, в отличие от трансформантов, мЭСК сохраняют стабильный кариотип и могут дифференцироваться в направлении трех зародышевых листков. По свойствам мЭСК имеют сходство с клетками эмбриональных карцином, которые экспрессируют некоторые маркеры мЭСК и даже сохраняют ограниченный потенциал к дифференцировке , i, . Работы на эмбриональных карциномах предшествовали исследованию мЭСК и вдохновили исследователей на получение линий мЭСК. Были опубликованы работы, в которых авторы показывали, что клетки эмбриональных карцином участвовали в развитии зародыша после введения в бластоцисту i, . Эти работы дали повод предполагать, что нерегулируемая пролиферация клеток эмбриональных тсратокарцином может оказаться под контролем при попадании клеток в соответствующее окружение. В соответствии с этим, мЭСК участвуют в эмбриогенезе, дифференцируясь во все без исключения клетки зародыша при введении в бластоцисту. Однако мЭСК обладают свойствами туморогенных клеток и образуют опухоли при подкожном введении мышам i, . Сходно с примитивными клетками зародышевого пути и тератокарциномами мЭСК обладают способностью к самообновлению, то есть к делению с сохранением признаков недифференцированных клегок , i, . Для сохранения плюрипотентности мЭСК необходимо присутствие фактора I, цитокина семейства I6 и эмбриональной сыворотки в среде культивирования i . В настоящее время активно исследуются механизмы, обеспечивающие сохранение недифференцированного состояния мЭСК. Статус плюрипотентных клеток обеспечивается экспрессией определенных транскрипционных факторов, в частности 4, , x1 и других i . Убедительно показано, что для сохранения плюрипотентности мЭСК необходима активация пути I3 i . Рассматривается возможная роль в самообновлении и сохранении плюрипотентного статуса мЭСК других сигнальных путей, опосредованных, Ркиной, Ркатенином, , , i, .