Генетический полиморфизм в клонах опухолевых линий гепатомы МГ-22А и саркомы J-774 мыши при разных условиях пролиферации и апоптозе

• Автор: Александрова, Светлана Алексеевна
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 144 с. : ил.

1. ВВЕДЕНИЕ
2. ЛИТЕРА ТУРНЫЙ ОБЗОР
2.1. Генетические перестройки в онтогенезе эукариот
2.1.1. Особенности структуры генома и его изменчивость
2.1.2. Роль мобильных генетических элементов в изменчивости генома
2.1.3. Изменения генома в генеративных и соматических клетках, необходимые для нормального онтогенеза
2.1.4. Генетические перестройки, имеющие значение в адаптации и видообразовании
2.1.5. Изменения в генетическом аппарате клетки при наследственных и спорадических заболеваниях
2.2. ПЦР-фингерпринт как метод для изучения геномного полиморфизма. Варианты метода
2.2.1.1ЯЗ-ПЦР
2.2.2. АР-ПЦР
2.2.3. ИАРО-ПЦР
2.3. Особенности канцерогенеза, изучаемые с помощью ПЦР-фингерпринта
2.3.1. Молекулярно-генетические маркеры злокачественного роста
2.3.2. Прогрессия опухолей и прижизненный анализ
2.3.3. Выявление активности онкогенов
2.3.4.Генные и хромосомные перестройки
2.3.5.Выявление потери гетерозиготности генов-супрессоров опухолевого роста
2.3.6. Идентификация генов
2.3.7. Неспецифические геномные перестройки. Микросателлитная нестабильность
2.4. Сохранение способности опухолевых клеток к дифференцировке при разных условиях их пролиферации
2.5. Роль апоптоза при злокачественной трансформации клетки и прогрессии опухолей
2.5.1. Апоптоз при нормальном развитии организма
2.5.2. Апоптоз при злокачественном росте и генетическая вариабельность опухолевых клеток
2.5.3. Фунционирование системы Газ-рецетор/Раэ-лиганд при взаимодействии опухолевых клеток с иммунной системой
3. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
3.1.Материал

3.1.1. Опухолевые клеточные линии
3.1.2. Линейные мыши
3.2. Методы
3.2.1. Выделение высокомолекулярной ДНК
3.2.2. ЛАРО-ПЦР
3.2.3. Индукция дифференцировки опухолевых клеток и морфологическое исследование опухолей
3.2.4. Взаимоиндукция апоптоза опухолевыми клетками и лимфоцитами
3.2.5. Выявление апоптоза опухолевых клеток и спленоцитов
3.2.6. Выделение тотальной РНК
3.2.7. Обратно-транскриптазная полимеразная цепная реакция
3.2.8. Секвенирование ПЦР-фрагментов
4. РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1. Полиморфизм амплифицированных фрагментов ДНК в клетках клонов гепатомы мыши МГ-22а, выявленный методом RAPD-ПЦР
4.2. Характеристика генетической структуры популяции опухолевых гепатоцитов МГ-22а
4.3. Жизнеспособность клонов гепатомы МГ-22а с разной степенью генетической изменчивости
4.4. Морфологические характеристики опухолей, выросших в ПСТи ПКГ
4.5. Полиморфизм амплифицированных фрагментов ДНК в клетках клонов гепатомы мыши МГ-22а, выявленный методом RAPD-ПЦР, при разных условиях культивирования in vivo
4.6. Определение нуклеотидной последовательности амплифицированного фрагмента ДНК
4.7. Взаимоиндукция апоптоза в клоновыхлиниях гепатомы МГ■22а и саркомы J-774 мыши и сингенными спленоцитами
4.8. Генетическая гетерогенность и взаимоиндукция апоптоза опухолевых гепатоцитов МГ-22а и спленоцитов
4.9. Экспрессия Fas и FasL в популяциях и клонах клеточных линий МГ-22а и J-774 мыши in vitm
4.10. Экспрессия Fas и FasL в опухолевых гепатоцитах МГ-22а, гистиоцитах J-774 и сингенных спленоцитах при их пассировании in vivo
4.11. Экспрессия Fas и FasL в опухолевых гепатоцитах МГ-22а, гистиоцитах J-774 и сингенных спленоцитах при их совместном культивировании in vitro
4.12. Способность к апопотозу и экспрессия Fas и FasL в опухолевых клетках МГ-22а и J-774 и сингенных спленоцитах при их совместном культивировании in vitro
5. ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА

В1-АФ ДНК - В1-ассоциированные фрагменты ДНК ИГВ - индекс генетической вариабельности МЭ - мобильные элементы
ОТ-ПЦР - обратно-транскриптазная полимеразная цепная реакция
п.н. - пара нуклеотидов
ПКГ - передняя камера глаза
ПСТ - подкожная соединительная ткань
ПЦР - полимеразная цепная реакция
т.п.н. - тысяча пар нуклеотидов
AP-PCR - Arbitraiyly Primed PCR
Fas - Fas-рецептор
FasL - Fas-лиганд
IRS-PCR - Interspersed Repeat Sequences PCR LINEs - Long Interspersed Nucleotid Elements NPHCC - Nonpolyposis Heredity Colon Cancer PCR - Polymerase Chain Reaction RAPD-PCR- Random Amplified Polymorphic DNA PCR
RAPD-ПЦР (Random Amplified Polymorphic DNA PCR) - полимеразная цепная
реакция с использованием случайных праймеров
SINEs - Short Interspersed Nucleotid Elements
TNF - суперсемейство рецепторов факторов некроза опухоли

3. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
3.1.Материал
3.1.1. Опухолевые клеточные линии
Клеточные линии гепатомы мыши МГ-22а и гистиоцитарной саркомы J-774 были получены из Музея клеточных культур Института цитологии РАН. Клетки культивировали в среде ДМЕМ («Биолот», Санкт-Петербург), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) («Биолот»), 2 мМ L-глютамина, 40 мкг/мл гентамицина, при 37 °С в увлажненной атмосфере с 5% СОг.
Для получения клоновых линий клетки гепатомы МГ-22а и гистиоцитарной саркомы J-774 рассевали по 200 штук на пластиковые чашки Петри (35 мм) и культивировали в среде ДМЕМ с 10% ЭТС. Клоны размером 3 мм в диаметре изолировали, переносили в отдельные чашки О* Петри и продолжали культивирование при тех же условиях.
Клеточная линия гепатомы мыши МГ-22а была получена из гепатомы, индуцированной метилхолантреном у мышей линии СЗНА. Она культивировалась in vitro в течение длительного времени и имела вполне стабильный характер. Известно, что гепатома МГ-22а имеет анеуплоидный набор хромосом с модальным классом 55 (Алексанян и ДР., 1972).
Клеточная линия гистиоцитарной саркомы J-774 была получена из перитонеальных макрофагов мышей линии Balb/c и состояла из крупных округлых полиморфных клеток. Клеточная линия ведется в стандартных условиях и может быть клонирована (Yong et al., 1984).
3.1.2. Линейные мыши
В работе были использованы линейные мыши: взрослые особи 3-6-месячного возраста линий СЗНА и Balb/c. Для исследования брали печень, также для индукции апоптоза были использованы спленоциты из селезенок взрослых самцов мышей линии СЗНА или Balb/c. Мыши были получены из питомника "Рапполово" РАМН. Воду и натуральные корма мыши получали ad libitum. Животных содержали в клетках по 5-6 особей.