Интенсивная технология получения низина с использованием мутантного штамма Lactococcus lactis

• Автор: Гула, Елена Александровна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 133 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. Обзор литературы

1.1 Биогенез и свойства низина.

1.1.1 Структура низина

1.1.2 Свойства и механизм действия низина

1.1.3 Организация кластера генов низина

1Л .4 Регуляция биосинтеза низина

1Л .5. Возможные механизмы защиты клеток продуцента от низина

1.2 Мульгилекарственная резистентность у молочнокислых бактерий

1.3 Метаболизм молочнокислых бактерий

1.3.1 Питательные потребности и протеолиз белков
1.3.1.1. Питательные потребности молочнокислых бактерий
1 .ЗЛ .2. Протеиназы молочнокислых бактерий
1.3Л.З. Продукты расщепления казеина.
1.3 Л .4. Аминокислотные и пептидные транспортные системы
1.4 Углеводный метаболизм.
1.4.1 Регуляция гликолиза.
1.4.2 Влияние углеводов на биосинтез низина
1.4.3 Регуляция утилизации углеводов.
1.5. Применение низина.
ГЛАВА 2 Материалы и методы.
2.1 Штаммы, использованные в работе
2.2 Питательные среды
2.2.1 Агаризованные среды для проведения селекционной работы, поддержания и хранения культуры ЕаМососсиз 1асНя вибэр. 1асШ
2.2.2 Среды для глубинного культивирования ЬЛасШ яиЬяр. асю
в колбах.
2.2.3 Среды для глубинного культивирования ЬЛасШ яиЬэр. 1асИя
в аппарате.
2.3 Хранение, поддержание и глубинное культивирование продуцента
низина.
2.4. Морфологическая характеристика культуры.
2.5 Методика определения активности низина.
2.6. Получение мутантов, устойчивых к антибиотикам.
2.7. Определение редуцирующих веществ методом Бертрана.
2.8 Определение редуцирующих веществ методом ТСХ.
2.9. Тесты на чувствительность к антимикробным агентам.
2 Чувствительность к деоксиглюкозе.
2 Чувствительность к окислительному стрессу
2 Определение титра клеток.
2 Определение содержания молочной кислоты
2 Определение протеолитической активности
2. Определение среды
2. Метод определения ак Капель 5
2. Статистическая обработка данных.
ГЛАВА 3 Результаты и обсуждения
3.1. Схема экспериментальных исследований
3.2 Условия поддержания культуры.
3.3 Получение нового высокопродуктивного штамма
3.4 Характеристика нового бацитрацинустойчивого штамма.
3.4.1. Сравнение ферментационных характеристик мутанта и
исходного штамма
3.4.2 Устойчивость к бацитрацину.
3.4.3. Чувствительность исходного штамма и мутанта к
различным антимикробным агентам.
3.4.4 Чувствительность исходного штамма и мутанта к низинуА
3.4.5. Устойчивость к окислительному стрессу.
3.4.6. Биосинтез низина при утилизации различных углеводов
3.5. Модификация технологии получения низина с ипользованием штамма ЬаМососсш 1асШ вар..
3.5.1. Влияние режимов фильтрации ферментационной среды
на биосинтез низина.
3.5.2. Оптимизация ферментационной среды по составу
белковых субстратов.
3.6. Обсуждение результатов
ГЛАВА 4 Биосинтез низина в промышленных условиях
4.1. Технология производства низина.
4.2. Утилизация отходов производства низина.
4.3. Экономическая оценка себестоимости продукта с использованием предлагаемых изменений
4.3.1. Расчет экономического эффекта при использовании мутанта
4.3.2. Расчет экономического эффекта при замене молочной среды на среду, содержащую соевую муку
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Разработан способ подготовки альтернативной среды для выращивания ЬЛас, содержащей протеолизат соевой муки, при котором сокращается время приготовления среды и обогащается состав среды необходимыми культуре питательными компонентами. Модифицирован способ поддержания Подобрана альтернативная ферментационная среда для ЫасНя, содержащая гидролизат соевой муки, что позволяет избежать использования дорогостоящего сырья молока, и снизить стоимость питательной среды в 4 раза. Себестоимость продукта от использования новой ферментационной среды в технологии получения низина снизилась на . Подобран эффективный способ подготовки питательной среды для культивирования продуцента низина, при котором сокращается время приготовления среды и обогащается состав среды питательными компонентами. Замена на стадии осветления ферментационной среды ультрафильтрации кДа на микрофильтрацию 0, мкм привела к увеличению выхода низина на за счет дополнительного обогащения питательной среды петидами и сокращения времени фильтрации в 1,5 раза. Новый штамм НасИя эиЬьр. Ш Всгя, способный за часов ферментации синтезировать до тыс. МЕмл низина А, апробирован при промышленном производстве низина на предприятии ООО ФирмаМакофарм г. Лотошино. Себестоимость продукта от использования нового штамма в технологии получения низина снизилась на . Апробация работы. Результаты диссертационной работы докладывались на и ой Пущинской школеконференции молодых ученых Биотехнологиянаука XXI века, Пущино, , гг. Всеросийской выставке научнотехнического творчества молодежи НТТМ, Москва, г. МГУИЭ, Москва, . Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 1 статья в сборнике научных трудов МГУИЭ, 1 статья в журнале Масложировая промышленность, тезисов докладов 5 на научных конференциях. Данные исследования выполнены в соавторстве с к. Сергеевой . ., к. Мироновым В. А., д. Бирюковым В. В. и др. Соискателем были выполнены постановка задач исследований, основные экспериментальные исследования, обработка данных и обобщение результатов. В селекционных работах и определении биохимических характеристик принимали участие Кудрина Н. И., Петрищева . . Обсуждение результатов проводилось совместно с Сергеевой . ., Мироновым В. А., Бирюковым В. В. Вклад соискателя в работу является определяющим. ГЛАВА 1. Низин это антибактериальное вещество, бактериоции, белковой природы, продуцируемое определенными штаммами молочно кислых бактерий i. Низин принадлежит к первому классу бактериоцинов лантибиотикам типа А , , ,2. Лантибиотики помимо обычных аминокислот содержат остатки редко встречающихся аминокислот лантионина и 3метиллантионина, связанных тиоэфирными связями. Поэтому эти бактериоцины именуются лантибиотиками , 3, 2. Лантибиотики рибосомально синтезируемые пептиды, которые образуют поры в цитоплазматической мембране или ингибируют ферменты. К особенностям лантибиотиков можно отнести 1 принцип их биологического действия, 2 биосинтез, в который вовлечены уникальные ферменты, 3 защита от продуцируемого продукта и 4 применение. На основании структуры и биологического действия лантибиотики подразделяют на 2 подкласса тип А и тип В , , , , , 3, 8. Лантибиотики типа А это удлиненные полипептиды, бактерицидная активность которых основана на первичном нарушении структуры мембран. Типичными представителями этой группы лантибиотиков являются низин , субтилин , эпидермин и галлидермин . Существуют три варианта низина низин А, низин и недавно открытый низин 4, 7. А содержит гистидин, а низин Ъ аспарагин 4. Низин О и низин А отличаются четырьмя аминокислотами в положении валин вместо аланина, в положении лейцин вместо метионина, в положении аспарагин вместо гистидина и в положении валин вместо изолейцина, соответственно. Низин С и низин Ъ отличаются таким же способом, за исключением того, что в положении оба они содержат аспарагин 7. Тип В это глобулярные молекулы, которые являются ингибиторами ферментов. Представители этой группы лантибиотиков дурамицин , циннамицин , анковенин 0 и актагардин , 9. В году и первыми расшифровали первичную структуру низина рис. А, В, С, и Е.