Получение трансгенных кроликов с геном интерферона-β1 человека

• Автор: Мартиросян, Валентина Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 123 с. : ил.

Содержание.
Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Методологические основы получения траисгенных животных.

1.1.1. Микроинъекция рекомбинантной ДНК в пронуклеус зиготы, значение метода.

1.1.2. Другие перспективные методы переноса чужеродной генетической информации в организм млекопитающих.

1.2. Методы анализа интеграции чужеродных генов.

1.2.1. Метод дот и блотгибридизации по Саузерну.

1.2.2. Метод полимеразной цепной реакции в применении к анализу трансгенных животных.

1.2.3. Визуализация чужеродных генов при использовании геновмаркеров.

1.3. Особенности экспрессии чужеродных генов в организме трансгенных животных.

1.3.1. Значение регуляторных последовательностей целевых генов для экспрессии в организме животного.
1.3.2. Использование мсталлотиониинового промотора при создании экспрессирующихся векторов для трансгенных животных.
1.4. Возможности практического использования трансгенных сельскохозяйственных животных.
1.4.1. Трансгенные сельскохозяйственные животные как продуценты биологически активных веществ.
1.4.2. Изменение хозяйственнополезных признаков у трансгенных животных.
1.4.3. Трансгенез как способ повышения устойчивости животных к неблагоприятным условиям, болезням и другим стрессфакторам.
1.5. Кролики в биотехнологии лабораторные животные в изучении трансгенеза и трансгенные животныепродуценты биологически активных веществ.
1.6. Значение исследования и применения интерферонов для молекулярной биологии, медицины, сельского хозяйства, биотехнологии.
1.7. Общие сведения о структурной организации гена интерферонар1 человека и некоторых физикохимических свойствах.
1.8. Перспективы получения и использования трансгенных сельскохозяйственных животных с генами интерферонов, и, в частности, с геном интерферонаР1 человека.
2. Материалы и методы.
2.1. Бактериальные штаммы.
2.2. Плазмиды.
2.3. Кролики.
2.4. Трансформация.
2.5 Выделение ДНК.
2.5.1. Выделение ДНК кролика.
2.5.2. Аналитическое выделение ДНК плазмид.
2.5.3. Препаративное выделение ДНК плазмид.
2.5.4. Элюция фрагментов ДНК плазмид.
2.6. Конструирование вектора рМТ1РЫр 1.
2.7. Препараты ферментов.
2.8. Олигонуклеотидные праймеры.
2.9. Микроинъекция.
2 Трансплантация эмбрионов.
2 Полимеразная цепная реакция.
2 Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК.
2 Блотгибридизация.
2 Внутрикожное заражение кроликов вирусом миксоматоза.
2 Заражение кроликов лапинизированным вирусом классической чумы свиней.
2 Размножение трансгенных кроликов.
2 Определение активности интерферона в сыворотке крови .
2 Изучение индуцированной экспрессии гена интерферона.
3. Результаты исследований.
3.1. Конструирование вектора с геном интерферонар человека иод контролем металлотиониинового промотора , потенциально способного экспрессироваться в клетках млекопитающих.
3.2. Проведение микроинъекций плазмидной ДНК в оплдотворенные яйцеклетки кролика и пересадка их животнымреципиентам.
3.3. Анализ родившихся крольчат на наличие гена интерферонар человека в геноме.
3.4. Определение титра интерферонаР1 человека в сыворотке крови трансгенов.
3.5. Изучение устойчивости к вирусным заболеваниям особей с установленной интеграцией целевого гена.
3.5.1. Устойчивость к заболеванию миксоматозом.
3.5.2. Иммунный статус кроликов при заражении классической чумой свиней и вирусом миксомы.
3.6. Воспроизводительная способность трансгенных кроликов с геном Р1интерферона человека путем разных форм скрещивания.
3.7. Изучение возможности передачи чужеродного гена потомству.
4. Обсуждение результатов исследований.
5. Выводы.
7. Практические предложения.
8. Список литературы
Введение.
Актуальность


Изучение экспрессии данного гена исследование возможности трансгенов противостоять инфекционным заболеваниям вирусной этиологии, а также формирование популяции трансгенных животных. Задачи исследования. Сконструировать вектор с геном интерферонар 1 человека под контролем металлотионеинового промотора, потенциально способным экспрессироваться в клетках млекопитающих. Провести микроинъекцию плазмидной ДНК в оплодотворенные яйцеклетки кролика и пересадить их животномуреципиенту. Проанализировать родившихся крольчат на наличие в их геноме целевого гена. Провести опыты по определению устойчивости полученных трансгенных особей к заболеваниям вирусной этиологии. Изучить возможность передачи гена интерферонаР I человека потомству сформировать популяцию трансгенных животных с использованием разных вариантов скрещивания. Основные положения, выносимые на защиту. Конструирование вектора, содержащего ген интерферонар 1 человека под контролем индуцибельного металлотионеинового промотора. Получение трансгенных кроликов методом микроинъекций м в зиготы. Установление интеграции целевого гена в их геноме методом цепной полимеразной реакции. Изучение индуцированной экспрессии вектора в организме трансгенных особей. Показана наследственная устойчивость трансгенных особей к инфекционным заболеваниям вирусной этиологии, обусловленной введением в их геном гена интерферонаР 1 человека. Наследование гена интерферонар 1 человека у кроликов I и II поколения первичных трансгенных особей. Обзор литературы. Методологические основы получения трансгенных животных. Генетическое совершенствование животных базируется, главным образом, на мутационной изменчивости, а также комбинационной изменчивости, реализуемой при скрещивании различных пород и популяций животных. Развитие молекулярной биологии, молекулярной генетики и генной инженерии сделало возможным генетическую модификацию животных посредством внедрения в их геном новых генов. Трансгенные животные это индивидуумы, в геном которых искусственно введена дополнительная генетическая информация трансген. Такая информация представляет собой либо отдельный участок ДНК с собственными гомологичными регуляторными последовательностями эукариотическая транскрипционная единица, либо сконструированный из различных молекул ДНК гибридный рекомбинантный ген. Таким образом, трансген это искусственно введенный и интегрировавшийся в ДНК животных чужеродный ген , , ii , . Интеграция чужеродного генетического материала в геном животных и экспрессия целевых генов позволяет решать разнообразные задачи научного и прикладного характера. Получение трансгенных животных может быть использовано для улучшения полезных признаков сельскохозяйственных животных, создания животных с иммунитетом к вирусным заболеваниям, животных продуцентов биологически активных белков. Эрнст, Эрнст и др. Наиболее важные теоретические и экспериментальные достижения мировой науки в создании генетически модифицированных животных суммированы в таблице 1. Таблица 1. Достижении в использовании трансгенных технологий. Доставка чужеродной ДНК в ооциты кролика сперматозоидами . Получение трансгенных сельскохозяйственных животных методом микроинъекции . Эмбриональные химеры с использованием ЭСК Получение овец посредством пересадки ядер . Получение КРС методом пересадки ядер . Получение трансгенных мышей и свиней с помощью спермиев в качестве векторов. Получение трансгенного КРС методом микроинъекции Получение свиней методом пересадки ядер vi . Получение трансгенных мышей и свиней с помощью спермиев в качестве векторов. Получение трансгенного КРС методом микроинъекции Получение свиней методом пересадки ядер vi . Получение трансгенного КРС с помощью спермиев . Получение ЭСК приматов . Получение овец методом пересадки ядер фетальных и соматических клеток. Трансгенные овцы методом пересадки ядер трансформированных культивируемых клеток. Химерные трансгенные свиньи с использованием ПЗК i. Получение трансгенного КРС посредством пересадки ядер фетальных фибробластов псевдотипных регровирусных векторов пересадки ядер дифференцированных клеток ii . Получение свиней методом пересадки ядер v .