Внутривидовые и межвидовые гибридные популяции клеток и их биологические свойства

• Автор: Ставничий, Евгений Валерьевич
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Покров
• Количество страниц: 158 с. : ил

Оглавление
страница

Список сокращений.

1. Введение

1.1. Актуальность темы.

1.2. Цель работы и основные задачи исследований

1.3. Научная новизна.

1.4. Практическая значимость.

1.5. Основные положения, выносимые на защиту.

1.6. Апробация и публикация результатов

2. Обзор литературы

2.1. Клеточные культуры в биотехнологии
2.1.1. Первичные клеточные культуры
2.1.2. Перевиваемые клеточные линии
2.1.3. Культуры клеток системы мононуклеарных фагоцитов свиней
в вегеринарной вирусологии
2.1.4. Клеточные культуры в изучении вируса геморрагической болезни кроликов
2.2. Гибридизация соматических клеток животных.
2.3. Мутантные культуры клеток.
2.4. Заключение по обзору литературы.
3. Собственные исследования
3.1. Материалы и методы
3.1.1. Кул ьтуры клеток
3.1.2. Питательные среды.
3.1.3. Сыворотки.
3.1.4. Растворы и реагенты.
3.1.5. Вирусы
3.1.6. Оборудование
3.1.7. Методы культивирования клеток.
3.1.8. Методы клеточной гибридизации.
3.1.8.1. Слияние клеток с помощью ПЭ1 в монослое
3.1.8.2. Слияние клеток в суспензии
3.1.9. Цитоморфологические, кариологичсские и цитохимические методы.
3.1 Вирусолог ические методы.
3.1 Бактериологические методы
3.1 Статистическая обработка результатов исследований
Результаты исследований.
3.2. Получение клеточных культур партнеров гибридизации соматических клеток и изучение их биологических свойств
3.2.1. Биологическая характеристика мутантных клеточных линий.
3.2.1.1. Перевиваемые линии клеток тестикул поросенка, дефектные
по ферментам
3.2.1.2. Получение новых маркированных сублиний, устойчивых к высоким концентрациям антиметаболита.
3.2.1.3. Характеристика перевиваемой миогенной крысиной не злокачественной мутантной линии Яат2 4к.
3.2.1.4. Характеристика миеломной линии клеток мыши, дефектной по гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазе БР А4
3.2.1.5. Определение клонообразующей способности клеток мутантных линий ГГГП ТК 0, ПТП ГГФРГ 0и Ка1к
3.2.2. Получение первичной культуры альвеолярных макрофагов
лег кого свиньи.
3.2.3. Получение первичной культуры гепатоцитов новорожденных крольчат.
3.3. Гибридизация
3.3.1. Отработка и оптимизация некоторых параметров гибридизации
3.3.2. Гибридизация клеток ПТП ТК 0 х АМС и ПТП ГГФРТ
0 х АМС в монослое.
3.3.3. Гибридизация клеток в суспензии
3.4. Биологические свойства гибридных линий клеток
3.4.1. Культуры гибридных клеток ПТП ТК 0 х АМС
3.4.2. Культуры гибридных клеток ПТП ГГФРТ 0 х АМС
3.4.3. Получение и характеристика межвидовых гибридных культур
клеток Кагкх АМС.
3.4.4. Получение и биологические свойства межвидовых гибридных
культур клеток ПТП ТК0 х гепатоциты крольчонка
3.4.5. Получение и биологические свойства межвидовых гибридных
культур клеток ПТП ГГФРТ 0 х гепатоциты крольчонка
3.4.6. Изучение чувствительности межвидовых гибридных культур
клеток ПТП ТК0 х гепатоциты крольчонка и ПТП ГГФРТ 0 х гепатоциты крольчонка к вирусам ВГЬК и миксомы кроликов Ю
3.4.7. Результаты межвидовой гибридизации миеломной линии кле
ток мыши, дефектной по гипоксантинчуанинфосфорибозилтрансферазе, и легочных альвеолярных макрофагов свиньи 8Р А х АМС. ЮЗ
3.5. Получение рекомбинантных вирусов в клетках клональной
сублинии мутантных клеток тестикул поросенка ПТП ТК
4. Обсуждение.
5. Выводы.
6. Практические предложения.
Список литературы


Получение новых маркированных сублиний, устойчивых к высоким концентрациям антиметаболита. Характеристика перевиваемой миогенной крысиной не злокачественной мутантной линии Яат2 4к. Получение первичной культуры гепатоцитов новорожденных крольчат. АМС в монослое. Кагкх АМС. Р А х АМС. ПТП ТК
4. Обсуждение. Выводы. Практические предложения. Список литературы. Актуальность темы. Гибридизацию соматических клеток в полуселективной системе, когда одним из партнеров слияния являются первичноизолированные клетки, можно рассматривать как один из методов получения генетически трансформированных клеточных систем. Исследование этих искусственных биомоделей открывает новые методологические перспективы изучения вопросов регуляции биосинтетических процессов в клетках, расшифровки механизмов направленной экспрессии на основе переноса генов с интеграцией необходимого гена в специфическом локусе хромосомы и получения клеточных популяций с заданными биологическими свойствами, например, продуцентов биологически активных веществ и клеточных субстратов для вирусологических исследований. В основе этих исследований, направленных на решение как фундаментальных, так и прикладных вопросов современной биологии, лежит использование генетически маркированных клеточных линий, причем спектр таких культур крайне Офаничен . В ветеринарной вирусологии актуальной является проблема получения перевиваемых линий клеток, чувствительных к вирусам, для которых в настоящее время не существует пермиссивных перевиваемых клеточных систем, например для вируса репродуктивнореспираторного синдрома свиней РРСС, геморрагической болезни кроликов ГБК и других. Естественно пермиссивными клетками для вируса РРСС являются легочные альвеолярные макрофаги свиньи 2, 5, а цитохимическим маркером клеток системы мононуклеарных фагоцитов СМФ свиньи служит фермент неспецифическая эстераза 4. Поскольку клетки системы мононуклеарных фагоцитов i vi не размножаются, одним из путей поиска стабильного клеточного субстрата для изучения этого вируса может стать получение на их основе гибридных
клеточных популяций. Для вируса ГБК пермиссивная клеточная культура до сих пор не найдена 5, однако факт наибольшего накопления вируса i viv в тканях печени кролика , , 6 нацеливает на поиск пермиссивных клеток для гибридизации среди субпопуляций гепатоцитов этого вида животных. Актуальной остается и проблема получения дефектных по гену тимидинкиназы стабильных высокопродуктивных линий клеток, устойчивых к высоким концентрациям антиметаболитов, необходимых для успешного проведения молекулярнобиологических исследований в области конструирования и изучения рекомбинантных вирусов. В целом, для решения этих специфических задач клеточноинженерными методами, необходимы как новые маркированные линии клеток, так и оптимизированные методы выделения пермиссивных первичных клеток, получение соматических гибридов и изучение их биологических свойств. Целью настоящей работы являлось получение соматических клеточных гибридов, выделенных в результате слияния перевиваемых маркированных сублиний с первичноизолированными клетками животных, естественно пермиссивными к вирусам возбудителям болезней сельскохозяйственных животных, и изучение их биологических свойств. Изучить биологические свойства полученных внутривидовых и межвидовых гибридных линий клеток. Впервые с использованием маркированной клеточной линии ГТП ТК 0 получены рекомбинантные вирусы. Паспортизированы мутантные сублинии ПТП ТК 0 и ПТП ГГФРТ 0. Паспорта на культуры клеток утверждены директором ВНИИВВиМ. Обе новые маркированные сублинии депонированы во Всероссийской специализированной коллекции клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных ВСКК СХЖ Россельхозакадемии Национальной коллекции клеточных культур. Полученные мутантные сублинии клеток свиного происхождения Т ТК 0 и ПТП ГГФРТ 0 предложены для использования в исследованиях по внутривидовой и межвидовой гибридизации. Мутантная сублиния клеток ПТП ТК 0 предложена для использования при селекции рекомбинантных вирусов.