Инфекционная анемия: разработка диагностических тест-систем РДП и ИФА на основе антигена культурального вируса

• Автор: Люлькова, Лариса Сергеевна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Щелково
• Количество страниц: 166 с.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Вирус инфекционной анемии.

1.1.1. Эпизоотология инфекционной анемии лошадей.

1.1.2. Изучение вируса ИНАН i vi и i viv

1.1.3. Морфология и физикохимические свойства вируса ИНА

1.1.4. Структура и антигенные свойства вируса ИНАН

1.1.5. Культивирование вируса инфекционной анемии.

1.1.6. Серологическая диагностика инфекционной анемии

1.2. Иммуноферментный анализ .

1.2.1. Общая характеристика ИФА.

1.2.2. Гетерогенный твердофазный ИФА
1.2.3. Классификация методов гетерогенного ИФА
1.2.4. Методы получения иммуноферментных конъюгатов.
1.2.5. Выбор субстрата для ферментамаркера и интерпретация результатов иммуноферментного анализа.
1.2.6. Применение методов ИФА для определения специфических антител и вируса р Аг с целью диагностики инфекционной анемии
1.2.7. Заключение.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВ I1ИЯ
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Разработка методики получения очищенного и концентрированного вируса ИНАН
3.1.1. Качественный состав, активность и специфичность культуратыюго вируса антигена ИНА.
3.1.2. Концентрирование и частичная очистка вируса ИИ АН .
3.1.3. Очистка вируса ИНАН
3.2. Серологические, морфологические и физикохимические свойства культурального вируса р Аг ИНЛН.
3.2.1. Определение некоторых физикохимических характеристик культурального вируса ИНАН
3.2.2. Электронномикроскопическое исследование инфицированных вирусом ИНАН ККЭЛ
3.2.3. Индикация вируса ИНАН в ККЭЛ непрямым иммуноферментнмм метолом.
3.2.4. Индикация вируса ИНАН в КЛЛ
3.2.5. Определение инфекционной активности вируса ИНАН
3.2.6. Определение иммунологической идентичности антигенов из культурального вируса ИНАН и из ткани селезенки жеребенка .
3.2.7. Комиссионные испытания свойств штамма 3КВНИиТИБПВИЭВ культурального вируса ИНАН
3.3. Тесгсистема Днтигенспецнфическая сыворотка для диагностики инфекционной анемии лошадей ИАН в реакции диффузионной преципитации РДП в агаровом геле.
3.3.1. Активность титр и специфичность антигена из культурального вируса ИАН.
3.3.2. Активность титр и специфичность сыворотки
3.3.3. Активность титр и специфичность компонентов тестсистемы Антигенспецифическая сыворотка для диагностики инфекционной анемии лошадей ИНАН в реакции диффузионной преципитации РДП в агаровом геле.
3.3.3.1. Титрование сухого препарата антигена с контрольной положительной сывороткой
3.3.3.2. Титрование сухого препарата специфической сыворотки
3.3.3.3. Определение тестсистемы антигенспецифическая сыворотка .
3.3.3.4. Испытание тестсистемы с сыворотками крови здоровых и больных ИНАН лошадей
Сравнительные испытания тестсистемы для диагностики
ИНЛН в РДП.
Динамика накопления вирусспецифических преципитирующих антител в крови экспериментально инфицированных вирусом И 1АН лошадей
Иммуноферментный анализ для определения вирусспецифических антител и индикации антигена вируса ИНАН
олучение иммунопероксидазных конъюгатов
Фракционирование из сыворотки крови лошади.
Фракционирование антител из антивидовой сыворотки аффинной хроматографией
Конъюгированис антиО лошадь с ферментом пероксида
за из хрена ПХ.
Синтез иммунопероксидазного конъюгата 1йО ПХ.
Тестсистема ИФА для определения вирусспецифических антител в сыворотке крови лошадей
Определение условий и параметров проведения непрямого
Определение активности титра иммунных сывороток в непрямом ИФА.
Разработка тестсистемы для индикации антигена р вируса ИНАН в модифицированном конкурентном ИФА
Сравнительный анализ лабораторных методов индикации и
тестирования вируса р Аг ИНАН.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
ВЫВОДЫ
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Установлено, что изменения в гене Е1МУ, ответственном за кодирование поверхностных гликопротеинов р и р , приводит к изменению антигенных свойств оболочки вируса и тем самым вариабельности последнего в процессе персистирующей инфекции 1, 9, 0, 1. Разнообразие форм заболевания, пожизненное вирусоноситсльство больными животными, ограниченный круг хозяев, восприимчивых к вирусу, позволяет считать в настоящее время инфекционную анемию лошадей одной из важнейших теоретических и практических проблем ветеринарной вирусологии. Изучение вируса ИНАН долгое время находилось в стадии стагнации в связи с невозможностью воспроизведения инфекции на какихлибо лабораторных животных или культуре клеток. Толчком к исследованиям послужило открытие, что вирус может репродуцироваться в клетках костного мозга и культуре лейкоцитов лошади I, , 0, 5, 6. Размножение вируса на II сопровождается ярко выраженным цитопатическим эффектом ЦПЭ, что сделало возможным его качественное обнаружение i vi. Определение вируса, выделенного из различных органов и тканей больных лошадей, на I показало, что инфекционный агент ИНЛН присутствует практически во всех органах и тканях лошадей в период острой и активной стадии болезни. Японские исследователи установили, что у двух лошадей, экспериментально зараженных вирусом инфекционной анемией и убитых на четвертый и восьмой дни после заражения, наивысшне титры вируса в сыворотке крови, печени, селезенке, легких, почках, лимфатических узлах, миндалинах и костном мозге достигали значения 5 5 ,I0,5 см3. Репликацию вируса ИНАН i vi после экспериментального заражения лошадей изучали на I, взятой в качестве индикаторной системы . При последовательном титровании вируссодержащей сыворотки крови на I1 было найдено, что титр вируса постепенно нарастает, начиная со второгоседьмого дня после заражения и достигая максимума ,5 см3 в момент начала подъема температуры гсла в межтемпературные периоды вирус в сыворотке крови не обнаруживался, но к моменту следузощего реци
дива болезни регистрировался новый подъем тигра вируса, хотя и в меньшем значении до см3 9, 4. Методом флуоресценции авторы , 1, 2 изучали наличие, локализацию и тип клеток, содержащих вирусный антиген в органах и тканях экспериментально зараженных ИНАН лошадей. Вирусный антиген этим методом определялся через шесть дней после заражения. Отчетливая цитоплазматическая флуоресценция была наиболее выражена в лимфоузлах селезенки и печени, почках, легких и костном мозге. Кроме того, флуоресценция наблюдалась в почечных, мезентеральных, мандибулярных, первикальных, бронхиальных, префеморальных, прекапсулярных лимфоузлах, в мозжечке, задней доле гипофиза, сердце, желудке, в тонком кишечнике, поджелудочной железе, надпочечниках и тимусе. Антиген в основном определялся в одиночных клетках или в небольших группах клеток, являющихся макрофагами. В период максимума вирусной репликации флуоресценция наблюдалась во всех орг анах и тканях, которые содержат макрофаги 4, 1. Морфология и физикохимические свойства вируса ИНАН Репродуцированный в КЛЛ вирус ИНАН был изучен с помощью электронной микроскопии , , 4, 6, 0. В клетках инфицированной культуры обнаруживались сферические частицы диаметром 0 нм, обладающие простой мембраной и нуклеоидом диаметром нм. Вирус проявлялся в виде покрытых оболочкой частиц, некоторые из них имели на поверхности выросты, свойственные РНК опухолсобразующим вирусам . В вирионах наблюдали два типа ядер, подобно зрелым и незрелым частицам Стипа, которые отпочковывались от клеточной мембраны. Схожие частицы фиксировались в материалах из сывороток крови инфицированных лошадей, но не обнаруживались в контрольных унифицированных культурах клеток или в культурах, в которые вносили предварительно инкубированный со специфическими антителами вирус ИНАН, то есть после реакции нейтратизации 6. В настоящее время свойства вируса ИНАН изучены достаточно глубоко. Вирус имеет высокомолекулярную РНК, которая, как показал седиментационный анализ, распадается на быстрооссдающий компонент, составляющий около вирионный РНК 8 М.