Оптимизация процесса производства отечественного генно-инженерного инсулина человека

• Автор: Купцов, Василий Николаевич
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 137 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава I. Сахарный диабет

1.1 Классификация.

1.2 Клиника.

1.3 Лечение сахарного диабета.

1.4 Показания к применению инсулина человека

Глава И. Открытие инсулина и его свойств

2.1 История открытия инсулина.

2.2 Структура инсулина .

2.3 Биосинтез и секреция инсулина.

2.4 Аномальные инсулины человека
2.5 Применение мутантных ГИИЧ в лечебных целях
Глава III. Получение инсулина.
3.1 Химический синтез инсулина человека.
3.2 Получение полусинтетического инсулина.
3.3 Синтетикоферментативный метод получения инсулина человека
3.4 Получение генноинженерного инсулина человека.
3.4.1 Использование эукариотов при производстве ГИИЧ
3.4.2. Получение ГИИЧ при использовании рекомбинантных штаммов . i
3.4.3. Ферменты, используемые при производстве ГИИЧ.
3.4.3.1. Трипсин
3.4.3.2. Карбоксипептвдаза В
3.4.4. Производство ГИИЧ в СССР и России
3.4.5. Современное производство ГИИЧ в России.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава IV. Материалы и методы
4.1 Материалы.
4.2 Исходный материал.
4.3 Оборудование
4.4 Анализ экспериментальных материалов.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Глава V. Разработка критериев оценки пригодности ферментов, используемых в производстве ГИИЧ при трансформации ГБ
5.1 Ферменты, применяемые при производстве ГИИЧ.
5.2 Схема тестирования образцов трипсина
5.3 Отбор препаратов трипсина, удовлетворяющих требованиям производства генноинженерного инсулина человека
5.4 Схема проверки новых партий карбоксипептидазы В.
Глава VI. Оптимизация процесса трансформации ГБ при получении инсулина
6.1 Постадийный гидролиз ГБ с выделением промежуточных продуктов трипсинолиза
6.2 Постадийный гидролиз ГБ трипсином и карбоксипептидазой В без выделения промежуточных продуктов трипсинолиза.
6.3 Одностадийный гидролиз ГБ трипсином и карбоксипептидазой В
6.3.1. Подбор оптимальной температуры для одностадийного гидролиза ГБ.
6.3.2 Подбор оптимального для одностадийного гидролиза ГБ
6.3.3 Подбор оптимальных условий подготовки ферментов для одностадийного гидролиза ГБ.
6.3.4 Подбор оптимальных концентраций ферментов для одностадийного гидролиза ГБ.
Глава VII. Оптимизация условий хроматографической очистки диаргинининсулина
7.1 Подбор оптимальной концентрации мочевины в буферных растворах.
7.2 Подбор оптимальной концентрации буферной соли в буферных растворах
7.3 Масштабирование экспериментальных результатов на промышленный процесс. 7 Глава VIII. Использование результатов экспериментов в производстве ГИИЧ.
8.1 Проведение препаративного совместного гидролиза ГБ при получении ГИИЧ
8.2 Проведение хроматографической очистки ГИИЧ на
Глава IX. Получение ГИИЧ при использовании нового ГБ.
9.1 Проведение триптического гидролиза I .
9.2 Разработка условий хроматографической очистки диаргинининсулина из трипсинолизата I
9.3 Разработка условий проведения совместного гидролиза I
9.4 Проведение экспериментальной хроматографии инсулина, полученного в результате совместного гидролиза I .
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Целью исследования стало усовершенствование технологии получения генноинженерного инсулина человека с целью снижения себестоимости и увеличения выхода конечного продукта. ГБ в инсулин с большим количеством промежуточных стадий т. Е.соИ М9рРШ. Практическая значимость. Предложен метод ферментолиза и хроматографической очистки, позволяющий повысить выход конечного продукта инсулина с единицы гибридного белка и значительно снизить себестоимость продукта за счет применения 2х М мочевины и замены импортных ферментов на отечественные. Разработанная технология получения инсулина применяется при производстве ГИИЧ на ОАО Национальные биотехнологии изменения к регламенту на производство субстанции генноинженерного инсулина человеческого ПР. Получена приоритетная заявку на патент РФ от на способ получения ГИИЧ. Использование результатов работы в производстве привело к увеличению производство ГИИЧ более чем в 3 раза, понизить себестоимость продукта на , при этом экономический эффект составил около млн. Новый способ гидролиза и очистки позволил получать конечный продукт с чистотой , что соответствует требованиям международной фармакопеи и ФСП на субстанцию инсулина. Разработанный алгоритм позволил статистически достоверно определять пригодность различных ферментных препаратов для нужд биотехнологического производства с наименьшими временными и денежными затратами. Технология получения первичного инсулина, основанная на результатах исследований процесса совместного гидролиза гибридного белка и новом методе очистки инсулина, позволила значительно увеличить выход готовой продукции и снизить издержки производства, используя существующее оборудование. Разработанные технологические примы легли в основу новой технологии получения генноинженерного инсулина на основе нового штаммапродуцента Е. Н ДМ9рН1. Изучено влияние температуры, и количества ферментов на результаты триптического и совместного гидролизов РШ7. Определено, что динамика накопления продуктов гидролиза при триптическом гидролизе ренатурированного гибридного белка, постоянна при условии, что гибридный белок состоит из лидерной последовательности, пептидного линкера ОБегНФуЗегАгд и проинсулина человека. Показано, что при очистке инсулина и его производных на сорбентах с сильными катионообменными свойствами например ЗРЗерЬагове БИ можно использовать буферные системы на основе ацетата аммония с низким содержанием мочевины до 2 М и менее без увеличения временных затрат при получении полупродукта той же чистоты, как и при использовании буферных систем с высоким содержанием 6 М и более мочевины. Данных результатов можно добиться путем увеличения ионной силы гидролизата и увеличения концентрации аммоний ацетата в используемых буферных растворах. Предложен универсальный метод получения первичного инсулина при использовании штаммовпродуцентов ГБ, имеющих различные лидерные последовательности. Разработан новый метод одновременного совместного гидролиза ГБ карбоксипептидазой В и трипсином в соотношении 1,1, в котором для уменьшения количества трудноотделимых примесей используется трипсин, инкубированный часа при 4 С в 0, ННС1. Разработан алгоритм позволяющий определить пригодность ферментативных препаратов для нужд биотехнологического производства генноинженерных препаратов. Показана возможность использования буферной системы на основе 2М мочевины при хроматографической очистке инсулина и его производных на при том же расходе буферных растворов и с той же эффективностью, что и при использовании буферной системы на основе 6М. Для этого необходимо увеличить ионную силу наносимого материала и увеличить содержание буферной соли в буферных растворах. Доказано, что проведение одновременного гидролиза гибридного белка ГИИЧ, состоящего из лидерной последовательности, пептидного линкера i и проинсулина человека, трипсином и карбоксипептидазой В необходимо проводить при 5 С, рН7Д0,1, и при соотношении гибридный белоктрипсинкарбокснпептидаза В 1,1. Перед использованием необходимо раствор трипсина в 0, Н НС1 с концентрацией мгмл инкубировать в течении часов при 4 С. Разработана новая универсальная и масштабируемая технология получения ГИИЧ на основе штаммапродуцента . I 1.