Интеграция и экспрессия экзогенов в молочной железе соматических трансгенных животных, полученных с использованием ретровирусных векторов

• Автор: Волкова, Наталья Александровна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Дубровицы, Московской обл.
• Количество страниц: 100 с. : ил

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Методы получения трансгенных животных

1.1.1. Микроинъекция

1.1.2. Эмбриональные стволовые клетки

1.1.3. Ретровирусные векторы

1.1.4. Аденовирусные векторы

1.1.5. Аденоассоциированные векторы

1.1.6. Липосомы

1.1.7. Спермин

1.2. Ретровирусы как векторы для переноса экзогенных генов
1.1.1. Молекулярногенетическая организация ретровирусов
1.1.2. Конструирование ретровирусных векторов
1.1.3. Основные этапы переноса чужеродных генов с помощью
ретровирусных векторов .
1.1.4. Использование ретровирусных векторов для направленного
переноса генов
1.3. Использование молочной железы животных для синтеза
рекомбинантных белков
1.3.1. Получение белков фармакологического назначения
1.3.2. Продукция рекомбинантных белков в молоко трансгенных
животных
1.4. Эритропоэтин биология, функции, методы получения
1.5. Биология, функции, получение и применение
гранулоци гарного колониестимулирующего фактора ГКСФ
1.6. Заключение по обзору литературы
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Реактивы и оборудование
2.2. Схема исследований и используемые векторные системы
2.3. Анализ животных на наличие рекомбинантной вставки
2.3.1. Экстракция ДНК
2.3.2. Определение концентрации ДНК
2.3.3. Полимеразная цепная реакция ПЦР
2.4. Анализ экспрессии трансгенных белков
2.4.1. Иммуноферментный анализ ИФА
2.4.2. i
2.5. Приготовление гистологических препаратов
3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Оценка клетокупаковщиц на наличие рекомбинантной
вставки
3.2. Введение ретровирусных векторов в молочную железу
сельскохозяйственных животных i viv
3.2.1. Эффективность трансформации клеток молочной железы
ретровирусным вектором
3.2.1.1. . Анализ интеграции генной конструкции
3.2.1.2. Исследование экспрессии рекомбинантного
эритропоэтина в молоко крупного рогатого скота и свиней
3.2.2. Эффективность трансформации клеток молочной железы ретровирусным вектором, содержащим генную
конструкцию рЬЫССБР
3.2.2.1. Анализ интеграции генной конструкции
3.2.2.2, .Экспрессия рекомбинантного ГКСФ в молоко
крупного рогатого скота и свиней
3.3. Влияние различных факторов на эффективность
трансформации клеток молочной железы i viv
3.3.1. Экспрессия рекомбинантного белка на протяжении лактации
3.3.2. Физиологическое состояние животных
3.3.3. Возраст животного
3.3.4. Вид животного
3.4. Исследование интеграции генных конструкций в клетках
других органов и тканей
4. ОБСУЖДЕНИЕ
5. ВЫВОДЫ
6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
8. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Причем, выделение данных белков из молока становится возможным уже при их концентрации от нгмл 1,,9,9,. Однако, стоимость производства трансгенных животных на сегодняшний день остается высокой. Кроме того, экспрессируемые уровни трансгена у крупных животных не всегда коррелируют с теми, которые были получены у лабораторных животных 3. Отрицательным моментом также является и то, что у крупных животных только 1 эмбрионов, микроинъецированных экзогенной ДНК, развивается в трансгенное животное, причем около из них не экспрессируют трансген 5,. В рамках данной проблемы актуальным является разработка методов получения трансгенных животных, характеризующихся высокой эффективностью трансгенеза и низкими материальными затратами. Как перспективный в данном отношении метод рассматривают использование ретровирусных векторов. По сравнению с другими типами векторов ретровирусы обладают уникальной способностью переносить чужеродные гены и стабильно интегрировать их в геном делящихся соматических клеток. На этом основано использование ретровирусных векторов для получения соматических трансгенных животных, т. Введение экзогенных генов в органы взрослых животных позволяет значительно сократить сроки с момента введения генных конструкций до получения первых данных об уровне экспрессии чужеродных белков, что особенно важно для животных, характеризующихся большим генерационным интервалом крупный рогатый скот, козы, свиньи. В связи с этим интересным представляется проведение экспериментов по переносу экзогенной ДНК с помощью ретровирусных векторов в клетки молочной железы сельскохозяйственных животных с целью получения продуцентов рекомбинантных белков. Цель и задачи исследования. Исходя из вышеизложенного, целью диссертационной работы явилось изучение интеграции и экспрессии экгогеной ДНК в молочной железе соматических трансгенных животных, полученных с использованием ретровирусных векторов. Провести анализ распространения ретровирусных векторов в других органах и тканях опытных животных. Научная новизна. В ходе выполнения диссертационной работы впервые подробно была изучена эффективность использования ретровирусных векторов, содержащих гены гранулоцитарного колониестимулирующего фактора и эритропоэтина человека, для осуществления локальной трансформации отдельных органов, в частности молочной железы коров и свиней. Была исследована динамика экспрессии рекомбинантного эритропоэтина и гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека в молоке опытных животных в течение лактации. Выявлено влияние лактации, времени введения генных конструкций в молочную железу, возраста и вида животных на уровень экспрессии рекомбинантного белка в молоко. Практическая значимость работы. Показана возможность использования ретровирусных векторов для получения животных продуцентов рекомбинантных белков. Изучены факторы, влияющие на уровень экспрессии рекомбинантного белка в молоко. Возможность доставки генных конструкций эритропоэтина и гранулоцитарного колониестимулирующего фактора в секреторные клетки вымени на основе использования ретровирусных векторных систем, вводимых в молочную железу. Синтез рекомбинантного белка в молоко в течение лактации носит периодический характер. Распространение ретровирусных векторов наблюдается как в месте инъекции, так и в других органах и тканях. Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международной конференции ДНКгехнологии в клеточной инженерии и маркировании признаков сельскохозяйственных животных, ВИЖ, п. Дубровицы, конференции аспирантов и молодых ученых, ВИЖ, п. Дубровицы, международной научнопрактической конференции Повышение конкурентноспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения, Быково, , научных отчетах ВИЖа за . Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 4 работы. Структура и объм работы. Диссертация изложена на 0 страницах, содержит таблиц, рисунков, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований, обсуждения, выводов, практических предложений. Список литературы включает 0 источников.