Метилотрофные бактерии как основа биотехнологического получения стабильно меченых биологически активных соединений

• Автор: Складнев, Дмитрий Анатольевич
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 205 с. : ил.

Введение к главе обзор литературы

.1. Отбор форм i i i, синтезирующих дейтероинозин.

.2. Выделение и изучение уровня включения дейтерия в дейтероинозине.

.3. Синтез дейтеротимидина клетками i ii.

.4. Получение униформно дейтерированного 6эндотоксина i iii.

. Получение стабильно меченых биологически активных соединений,

синтезируемых архсобактсриями i ii

Введение к главе обзор литературы

.1. Отбор форм II. ii, адаптированых к высокодейтернрованным средам

.2. Оптимизация состава высокодейтерированной ростовой среды.

.3. Выделение и исследование липидов археобактерий Н.ii

.4. Выделение и исследование белковых аминокислот .ii.
.5. Синтез бактсриородопсина, меченного дейтероаминокислотами
.6. Изучение распределения изотопов водорода при культивировании .ii
на высокодейтерированной полноценной ростовой среде.
. Получение стабильно меченого антибиотика зервамицина, синтезируемого
культурой мицслиального гриба ii i.
Введение к главе обзор литературы.
.1. Оптимизация метода выделения и очистки зервамицина.
.2. Опримизациа условий и состава ростовых сред для биосинтеза зервамицина
.3. Получение зервамицина, униформно меченого дейтерием
.4. Получение зервамицина, меченного 5i.
.5. Получение униформно Ымечснного зервамицина
.6. Определение биологической акшвности стабильно меченых препаратов зервамицина.
. Реутилизация использованной тяжлой воды и стабильно меченых биомасс
V. ВЫВОДЫ
VI. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
I.ВВЕДЕНИЕ.
Настоящая работа посвящена исследованию научных основ использования метилотрофньгх бактерий для биотехнологического получения биологически активных соединений, меченных атомами стабильных изотопов. Получаемые меченые соединения предназначены для использования как в структурнофункциональных биохимических и фармакокинетических научных исследованиях, так и в различных областях медицины.
Основные открытия естествознания последней четверти XX века не были бы возможны без огромных успехов в электронном приборостроении и в области тонких химических технологий. Именно благодаря разработке вс более совершенного научного оборудования, позволяющего регистрировать и анализировать вс более тонкие молекулярные взаимодействия, пополняются наши знания. И именно на фоне развития мирового рынка особо чистых реактивов появляются возможности сравнительно легко обнаруживать, выделять, исследовать и модифицировать практически любые биологические соединения и структуры. Маркирование биомолекул для проведения таких работ может осуществляться только на молекулярном уровне. Применение радиоизотопов в таких экспериментах ограничивается опасностью для объекта исследования, а также из за наведнных радиационных эффектов на соседние молекулы. Использование стабильной изотопной метки не имеет ограничений. Тем не менее каталоги изотопно меченых соединений предлагают весьма ограниченный круг веществ, а высокие цены ещ более сдерживают применение в научной и медицинской практике препаратов, представленных на этом секторе мирового рынка особо чистых реактивов. Вместе с тем, нельзя представить себе дальнейший прогресс в естественных науках и медицине без расширения применения именно этой методологии методологии стабильных изотопов.
Данная работа демонстрирует возможности использования биосинтетического потенциала метилотрофных бактерий для существенного расширения спектра производства биологически активных соединений БАС, меченных атомами именно стабильных изотопов СМ.
Метилотрофы один из излюбленных объектов биотехнологических исследований, благодаря хорошим ростовым и биосинтетическим свойствам при доступности и низкой стоимости ростовых субстратов, непатогенности этих
микроорганизмов, наличию весьма специфических, но достаточно хорошо изученных ферментативных и регуляторных систем.
выделение СМ продукта культивирование приготовление культивирование
метилотрофов на СМ биомасса полноценных СМ вторичных
СОзСЮ и ОгО ростовых сред продуцентов
О приготовление выделение
полноценных СМ СМ продукта и ростовых сред
регенерация ОгО и обогащение по дейтерию
Общая схема предлагаемого подхода к получению СМ БАС тотально дейтерированных на основе использования метилотрофных бактерий, представлена на схеме. Первый этап состоит в культивировании метилотрофных бактерий на ростовых средах с низкомолекулярными источниками изотопной метки для конверсии атомов стабильных изотопов в компоненты метилотрофной биомассы метилотрофы первичные продуценты СМ биомассы. Источниками изотопной метки были наиболее доступные низкомолекулярные соединения, содержащие изотопы водорода дейтерий О 2Н, углерода 3С, азота ,5М. Поскольку среды не содержат немеченых соединений, основным продуктом, получаемым на этом этапе, является биомасса метилотрофов, тотально меченая по соответствующему типу атомов. После частичного разрушения автолиза этой СМ биомассы и приготовлении из не полноценных ростовых сред, на втором этапе проводится культивирование вторичных гетеротрофных продуцентов, синтезирующих специфические целевые СМ БАС в значительных количествах. Таким образом, предлагаемая схема может быть использована для получения любых классов меченых органических соединений, накапливаемых в клетках микроорганизмов, либо секретируемых в ростовую среду.
Поскольку стоимость всех соединений, включающих атомы стабильных изотопов, весьма высока, мы провели исследования, направленные на существенное снижение потерь изотопно меченых матсриаюв. В результате была отработана методика реутилизации тяжлой воды из ку1ьтуральных жидкостей, а также показана возможность использования любых препаратов СМ биомасс для приготовления следующих партий полноценных стабильно меченых ростовых сред.
Цель и задачи исследования. Основная цель работы состояла в разработке эффективной системы для получения любых СМ БАС, которые могут быть синтезированы клетками микроорганизмов разной таксономической принадлежности, на основе использования биотехнологического потенциала метилотрофных бактерий. В соответствии с этим в работе ставились следующие основные задачи
1. Определить условия, позволяющие культивировать различные метилотрофные бактерий на средах из тяжлой воды с дейтерометанолом в качестве единственного источника углерода и энергии. Изучить возможность получения БАС, тотально меченных дейтерием, 3С, К а также наработать препараты тотально меченой биомассы метилотрофов для выделения и исследования МС БАС.
2. Разработать методику приготовления полностью дейтерированных полноценных ростовых сред на основе высокодейтсрированной биомассы метилотрофов, а также иных вариантов сред, тотально меченых стабильными изотопами.
3. Проверить приемлемость этих сред для наработки разнообразных СМ БАС, синтезируемых различными гетеротрофными микроорганизмами.
4. Изучить распределение изотопов водорода при культивировании археобактерий на высокодсйтерированной ростовой среде.
5. Отработать метод реутилизации тяжлой воды и образцов стабильно меченой биомассы использованных микроорганизмов.
Актуальность


Состав радикалов менялся при увеличении влажности образцов за счт изменения доли радикалов дезоксирибозы. Выводы, сделанные авторами, достаточно расплывчаты, так как изза большого числа вариантов получаемых радикалов не удалось выяснить зависимость от условий их образования. Исследование механизмов действия антибиотиков с применением 2. Такая устойчивость обычно ассоциируется с зависимыми лактамазами, обнаруживаемыми в различных клинических изолятах, в том числе а бактериях i ii самых распространнных источниках гнойных хирургических инфекций. Вместе с тем использование тяжлой воды позволило зафиксировать кинетическую важность участия в реакции стадии переноса протона . Эти исследования также обнаружили накопление ферментсвязанного интермедиата реакции. Ещ один пример сравнительно простого, но изящного метода, примененного для установления наличия ферментативной активности, приводится в работе , , . Протонированный цитозинин нуклеиновую составляющую антибиотика бластицидина С и пиридоксальфосфат проинкубировали вместе в бссклсточном экстракте биомассы i, выращенной в ИгОсреде. Было зафиксировано включение атомов дейтерия в Н4 и Н2 позиции молекулы цитозинина. В контрольных экспериментах при кипячении смеси или если в смеси отсутствовали клеточные экстракты включения дейтерия не наблюдали. Это чтко указывало на присутствие в экстракте биомассы . С и, соответственно, подтверждало роль цитозинина как интермедиата в данной ветви биосинтеза антибиотика. Исследование структур различных белков с применением 2. Трудно переоценить значение исследований структурнофункциональных особенностей белков живых организмов. Традиционны способы изучения белковых структур с применением изотопных меток. Условно можно выделить два типа подходов изучение функционирования после структурного изменения белка или изучение функционирования при возможности контролировать поведение меченых фрагментов структуры. Первый тип включает в себя различные фрагментации, конформационные и термодинамические изменения, а также изменения, связанные с изменением окружения исследуемого белка. Второй тип фактически подразумевает получение изотопномеченого исследуемого белка, поэтому мы обратимся к соответствующим работам в следующих главах обзора. Рассмотрение действия тяжлой воды на белки начнм с упоминания исследования кристаллизации лизоцима яичного белка. Начальные стадии кристаллизации лизоцима при наличии высоких концентраций солей протекают довольно быстро. В данной работе изучали стартовый момент агрегации молекул лизоцима, растворнного в природной или тяжлой воде, на фоне высоких концентраций натрия или калия i, , . Скорость агрегации в Н не была ионспецифична и была ниже, чем в . Из раствора лизоцим кристаллизовался быстрее при наличии ионов калия. Таким образом, способность белковых молекул лизоцима к агрегации выше в тяжлой воде. К сожалению, авторы не обсуждают вопроса, насколько общим может оказаться этот эффект тяжлой воды на белковые кристаллы, однако можно надеяться, что интерес к данному вопросу повысится. Метод высоких давлений один из методов влияния на пространственную организацию белковых молекул. В качестве модельного глобулярного белка обычно используют небольшие белки, например, гурмарин аминокислот, выделенный из v. В кислой водной среде с добавлением даже 5 тяжлой воды возможно прямое измерение ядерного магнитного резонанса молекул белка 0 при варьируемом давлении 1бар. Соответственно, изменения в двумерных ii ixi и v спектрах можно оценивать как следствие изменения давления на белок. Такие исследования показали, что у большинства протонов амидов при повышении давления водородные связи укорачиваются в гой или иной степени, причм химический сдвиг амидных протонов, открытых для растворителя воды, более чувствителен к давлению, чем у внутренних водородных связей с карбонилами I . Наиболее значительный эффект давления обнаружился на внешние боковые протоны,Это позволило сделать вывод о заметных изменениях пространственной структуры гурмарина при линейном характере зависимости таких изменений от давления в использованном диапазоне.