Изучение некоторых свойств фазмиды N15 как потенциального фагового вектора

• Автор: Санькова, Татьяна Петровна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 120 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Плазмиды и фаги.

1.1. Основные свойства природных плазмид.

1.2. Свойства бактериофагов.

2. Векторы для клонирования в бактериях.

2.1. Общие свойства векторов

2.2. Фаговые векторы

2.3. Векторы риС

3. Свойства фазмиды .

3.1. Свойства фазмиды и структура ее генома.
3.1.1. Лизогенная конверсия фазмиды .
3.1.2. Физическая структура плазмидной и фаговой ДНК
3.1.3. Структура теломер и их образование.
3.1.4. Генетическая организация плазмидного генома
3.1.5. Сравнение последовательностей протеломеразы и интеграз.
3.2. Репликация линейной плазмиды
3.2.1. Модели репликации линейных ДНК.
3.2.2. Механизмы образования теломер
3.2.3. Репликация фазмиды .
И. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
1. Штаммы бактерий и бактериофагов
2. Плазмиды.
3. Среды
4. Общие методы работы с бактериями и бактериофагами
5. Транспозонный мутагенез фазмиды сЗ
6. Транспозонный мутагенез фазмиды 1я
7. Транспозонный мутагенез миниплазмиды ртВОб
8. Получение вариантов фазмиды с маркером устойчивости к
хлорамфениколу
9. Стабильность плазмидного состояния мутантов фазмиды
. Определение частоты лизогенизации клеток.
. Выделение плазмидной ДНК.
. Трансформация клеток Е. соИ
. Рестрикционный анализ плазмид
. Компьютерный аначиз последовательностей
III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ.
1. Изучение свойств фазмиды как лямбдоидного фага.
1.1. Сравнительное изучение антигенной активности фазмиды и лямбдоидных фагов X и ф.
1.2. Получение рекомбинантов фазмиды и лямбдоидного
2. Изучение условнолетальных мутантов фазмиды ,
дефектных по репликации.
2.1. Частота образования Ьи лизогенов ашмутантами фага
2.2. Стабильность плазмидного состояния 1Бмутантов фазмиды при непермиссивной температуре
2.3. Урожай фаговых частиц условнолетальных мутантов фазмиды на гесА штаммах при пермиссивных условиях
2.4. Картирование условнолетальных мутаций по репликации.
2.5. Компьютерный анализ продукта герА гена фазмиды .
3. Получение, характеристика и картирование инсерционных мутаций фазмиды .
3.1. Транспозонный мутагенез фазмиды
3.2. Физическое картирование транспозонных мутаций
3.3. Транспозонный мутагенез температурочувствительного мутанта .
3.4. Получение вариантов фазмиды с маркером устойчивости к хлорамфениколу
3.5. Транспозонный мутагенез линейной миниплазмиды .
3.6. Конструирование линейного плазмидного вектора
4. Изучение возможности увеличения размера генома при сохранении инфекционности фага
4.1. Получение варианта фазмиды , несущего два маркера устойчивости к антибиотикам.
4.2. Оценка плотности упаковки генетического материала в фаговом капсиде.
4.3. Получение и свойства рекомбинантной
плазмиды МСт1рНш
5. Получение свойства и картирование рекомбинантных линейных плазмид с чужеродным репликоном.
ОБСУЖДЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Аобласть генома фазмиды контролирует репликацию ДНК как в лизогенном состоянии в линейной форме, так и при литическом развитии в кольцевой форме. Области генома фага с координатами на линейной плазмидной карте ,0,2 т. Область, существенную для литического развития, составляют протяженные районы структурных генов и участок с координатами ,, т. , регулирующий литическое развитие фага. Участки генома, существенные для стабильного поддержания плазмидного состояния, расположены в координатах 0,1 т. и в области, правее координаты , т. ДНК фазмиды. Фаг сохраняет способность к вегетативному развитию при увеличении длины его генома, по крайней мере, на по сравнению с природной фаговой ДНК. Чужеродный мультикопийный репликон кольцевых плазмидных векторов в составе ДНК дефектной фазмиды осуществляет репликацию линейной ДНК с ковалентно замкнутыми теломероиодобными концами. Апробация работы. Материалы диссертации доложены на симпозиумах по молекулярной генетики бактерий и бактериофагов, i , НьюЙорк, и гг. II Съезде Бавиловского общества генетиков и селекционеров СанктПетербург, февраль г. Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ 9 0, МО РФ . I . Успехи генетической инженерии при решении прикладных задач дали толчок зарождению молекулярной биотехнологии. Уже с первых лет ее развития основными объектами генноинженерных экспериментов стали клетки ii i К, ее плазмиды и бактериофаги, которые используются организмами в качестве природных векторов при горизонтальном переносе генетического материала, способствующего эволюции. К тому же, именно они были и наиболее полно изучены генетически. Это позволило целенаправленно использовать их для конструирования новых типов векторных молекул, осуществления селекции реципиентных клеток, прогнозирования свойств рекомбинантных молекул ДНК и проведения их анализа. Плазмиды определяют как стабильно наследуемые внехромосомные генетические элементы. Они являются обычным компонентом бактериальных клеток, но встречаются также и у низших эукариотов. В большинстве случаев плазмиды представляют собой ковалентнозамкнутые кольцевые молекулы ДНК длиной от 2 до 0 тпн. Благодаря кольцевой структуре они не подвергаются действию экзонуклеаз. Существуют также линейные плазмиды, устойчивость которых к действию экзонуклеаз обеспечивается тем, что концы нитей их ДНК защищены белками или соединяются ковалентно i . i . Плазмиды обладают рядом общих свойств. Основным свойством является способность плазмид к автономной репликации. Молекулы ДНК приобретают ее в том случае, если в них имеется сайт начала репликации i ii начало и, как правило, набор генов, необходимых для ее осуществления. Такие молекулы получили название репликонов. Плазмидные ДНК могут иметь по несколько опсайтов. Репликоны функционируют лишь тогда, когда в клетках есть все необходимые для этого ферменты. В большинстве случаев кольцевые плазмиды граммотрицательных бактерий реплицируются однонаправленно в тетаформе Харди, . Минимальный размер плазмид со строгим контролем репликации т. Плазмиды с ослабленным контролем репликации обычно невелики по размеру не более т. Строгость контроля репликации плазмид заключается в наличии у них механизма ограничения числа копий до 1 3 молекул на клетку. При этом репликация кольцевых плазмид осуществляется, как правило, клеточными репликативными комплексами. В клетках . содержит четыре 9членных бокса консенсус ТТАТСУА САСА, с которыми связывается белок . Он плавит структуру ДНК в iсайте и при содействии белка способствует посадке на этот сайт геликазы . Образовавшийся комплекс распознается праймазой и ДНКполимеразой III , , что инициирует движение репликационных вилок в обоих направлениях. Плазмиды . , для которого в их iсайтах имеются боксы. Но основную роль в инициации репликации играют собственные инициаторные белки Яербелки, узнающие в плазмидных опсайтах специфические множественные прямые повторы. Плазмиды .