Разработка тест-систем на основе ПЦР и латекс-агглютинации для идентификации возбудителя сибирской язвы

• Автор: Конвисарев, Андрей Петрович
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Щелково
• Количество страниц: 106 с. : ил.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Эпизоотическая ситуация по сибирской язве.

2.2. Общая характеристика возбудителя сибирской язвы.

2.3. Патогенез и клинические проявления болезни

2.4. Характеристика природных плазмид бацилл.

2.5. Диагностика сибирской язвы

2.6. Применение реакции латексагглютинации в диагностике инфекционных болезней.

2.7. Идентификация возбуди теля сибирской язвы на основе

анализа генома.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Материалы.
3.1.1. Штаммы
3.1.2. Ферменты.
3.1.3. Реактивы
3.1.4. Растворы и питательные среды
3.1.5. Животные
3.1.6. Лабораторное оборудование.
3.2. Методы
3.2.1. Выращивание бактерий
3.2.2. Определение культуральноморфологических свойств
возбудителя сибирской язвы
3.2.3. Выделение хромосомной ДНК.
3.2.4. Электрофорез ДНК и полипептидов.
3.2.5. Иммуноблоттинг
3.2.6. Постановка полимеразной цепной реакции
3.2.7. Постановка реакции латекс агглютинации
3.2.8. Серологические исследования.
3.2.9. Компьютерный анализ, сравнение первичных структу р
нуклеиновых кислот и расчет олигонуклеотидов
4. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
4.1. Идентификация сибиреязвенных штаммов методом полимеразной цепной реакции
4.1.1. Разработка ПЦР для индикации возбудителя сибирской язвы.
4.1.1.1. Выявление капсулообразующих штаммов возбудителя сибирской язвы методом ПЦР.
4.1.1.2 Выявление возбудителя сибирской язвы методом ПЦР
на основе праймеров, комплементарных гену токсина
4.2. олучение растворимых антигенов Вас. апШгааз.и изучение их
специфической активности.
4.3. Разработка реакции латексагглютинации для выявления специфических антител и антигенов к возбудителя сибирской язвы.
4.3.1. Получение очищенных антигенов и
4.3.2. Отработка реакции латексагглютинации для выявления специфических антител к возбудителя сибирской язвы .
4.3.3. Отработка реакции латексагглютинации для дифференциации бацилл
4.4. Изучение возбудителя сибирской язвы, выделенного из органов павших животных и проб почв.
4 .4.1. Биологические свойства полевого изолята сибирской язвы.
4.4.2.Изучение диагностической ценности ПЦР для выявления ДНК
возбудителя сибирской язвы в пробах почвы скотомог ильника
5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
6. ВЫВОДЫ
7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
9. ПРИЛОЖЕНИЕ.
СПИСОК СОКРАЩЕНИИ
АТ антитело
агар КД сухая питательная среда на основе ферментативного гидролизата кормовых дрожжей
а.о. аминокислотный остаток
ГВП гииервариабельпые повторы
дсн додецилсульфат натрия
ДПС жидкая споруляциоиноростовая среда на основе пептона и дрожжевого экстракта
ед. единица
ИФА иммуноферментный анализ
КРС крупный рогатый скот
ЛФ летальный фактор, компонент сибиреязвенного токсина
МонАТ моноклональные антитела
МПБ мясопептонный бульон
МППБ мясопептонный печеночный бульон под вазелиновым маслом
МПА мясопептонный агар
н. нуклеотид
НК нуклеиновая кислота
ОРС открытая рамка считывания
ОФ отечный фактор, компонент сибиреязвенного токсина
ПААГ полиакриламидный гель
п.о. пар оснований
ПДРФ полиморфизм длин рестрикционных фрагментов
ПЦР полимеразная цепная реакция
ПА протективный антиген, компонент сибиреязвенного токсина
РАЛ реакция агглютинации латекса
РИГА реакция непрямой гемагглютинации
РНК рибонуклеиновая кислота
РП реакция преципитации
СВК среда для выделения и культивирования сибиреязвенного микроба
т.п.о. тысяч пар оснований
трис трис гидроксиметил амином етан
ФСБ фосфатносолевой буфер
ЭДТА этилендиамин тетраацетат
сШТР дезоксинуклеозидтрифосфат
ЬВ среда ЛурияБертана.
1. ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Продолжительный и комплексный характер исследований при идентификации предназначен для исключения диагностических ошибок, которые могут иметь место изза таксономической схожести представителей рода i, когда отдельные идентификационные критерии различных видов бацилл могут совпадать. Достоверным отличительным признаком вирулентных штаммов . Однако постановка биопробы это наиболее продолжительный по времени и не всегда доступный идентификационный тест, а, кроме того, этот метод не позволяет идентифицировать бескапсульные штаммы возбудителя. Длительность, трудоемкость, недостаточная специфичность и чувствительность применяемых в настоящее время методов заставляет исследователей обратить особое внимание на разработку и внедрение в ветеринарную практику новых высокочувствительных и специфичных методов диагностики возбудителя сибирской язвы, основанных на анализе генома и антигенных детерминант, позволяющих надежно выявлять возбудитель в объектах ветеринарного надзора. Нуклеотидные последовательности генов, связанных с патогенностью бактерий, используются при разработке ПЦРдиагностикумов. Исследования в области молекулярной биологии сибиреязвенного микроба показали присутствие в клетках вирулентных штаммов плазмид с молекулярной массой и 0 МДа, на которых локализованы гены двух факторов патогенности капсул ообразования и трехкомпонентного токсина, соответственно. Эффективные диагностические препараты при сибирской язве могут быть созданы путем разработки серологических методов, основанных на использовании протективного антигена или его иммуногеиных доменов, а применение генетического маркирования детерминант сибиреязвенного токсина живых бактериальных вакцин позволит, в перспективе, разработать лабораторные тесты позволяющие дифференцировать вакцинные штаммы от вирулентных и авирулентных изолятов Вас. Таким образом, указанные обстоятельства свидетельствуют о необходимости изучения структурнофункциональной организации генома и разработки чувствительных и специфичных тестсистем на основе методов клеточной биотехнологии и генной инженерии для выявления возбудителя сибирской язвы, позволяющих дифференцировать его от других непатогенных представителей рода бацилл, особенно при изучении атипичных и смешанных культур, выделенных из проб почвы. Цель и задачи исследования. Основной целью данной работы являлась разработка тестсистем для идентификации возбудителя сибирской язвы и определение их значимости при проведении диагностических исследований на сибирскую язву. Бурятии и оценить пригодность ПЦР для идентификации возбудителя сибирской язвы. Научная новизна работы. Разработана чувствительная и специфичная тестсистема на основе ПЦР с использованием праймеров, комплементарных нуклеотидным последовательностям плазмид, определяющих вирулентные свойства и определены оптимальные условия ее проведения при выявлении ДНК возбудителя сибирской язвы. Изучен в сравнительном аспекте полипептидный состав растворимых антигенов вакцинного штамма ВНИИВВиМ и В. Установлено, что полипептидный состав антигенов, выделенных из вегетативных клеток и спор, а также из культуральной жидкости различаются между собой в зависимости от состава питательной среды и времени культивирования. При изучении культуральноморфологических свойств и проведении исследований с помощью ПЦР бацилл, выделенных из проб почв скотомогильника в местности Иркана Северобайкальского района Республики Бурятия, установлена изменчивость вирулентных свойств у выделенных сибиреязвенных штаммов. Практическая значимость работы. Разработана тестсистема на основе ПЦР для обнаружения фрагментов ДНК генов протективного антигена и капсульного оперона, пригодная для идентификации возбудителя сибирской язвы и дифференциации вирулентных капсулообразуюших штаммов от бескапсульных вакцинных штаммов. Разработанная тестсистема может быть использована в качестве сигнального метода при исследовании смешанных культур микроорганизмов, выделяемых из проб патологического материала, почвы, воды при подозрении на сибирскую язву.