Получение поликлональных антител к синтетическому пептиду прионного белка и определение их специфичности

• Автор: Савенко, Наталья Борисовна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 124 с. : ил.

Оглавление

Список условных сокращений

Введение

1. Обзор литературы

1.1. Современные методы детекции приоиов

1.2. Синтетические фрагменты прионных пептидов методики иммунизации животных.

1.3. Гибридизация соматических, миеломных и антител продуцирующих клеток с целью получения моноклональных антител

2. Собственные исследования

2.1. Материалы и методы

2.1.1. Культуры клеток, питательные среды

2.1.2. Вирусные штаммы.

2.1.3. Получение конъюгатов пептидов.
2.1.4. Лабораторные животные.
2.1.5. Получение асцитной жидкости.
2.1.5. Определение титра антител методом ИФА в крови иммунизированных животных и в асците.
2.1.6. Иммуноцитохимическое исследование клеточных
культур на наличие прионов.
2.1.7. Проведение Вестернблота
2.1.8. Выявление прионов методом ИФА.
2.2. Результаты
2.2.1. Получение поликлональных антител к синтетическому пептиду прионного белка. Оценка уровня антител в сыворотке
крови иммунизированных животных в ИФА
2.2.2. Иммуноцитохимическое исследование культур клеток, гистосрезов головного мозга и мазков крови.
2.2.3. Разработка метода выявления прионного протеина
в белковом препарате Бактивин Вестернблот анализом
2.2.4. Разработка методов иммуноферментного анализа
для выявления прионного протеина.
2.3. Гибридизация соматических и миеломных клеток с антителпродуцирующими клетками мышей и кроликов, характеристика полученных культур и определение
продукции моноклональных антител в культуральной среде.
3. Обсуждение
4. Выводы
5. Практические предложения
Список литературы


Поэтому разработка чувствительных специфических методов детекции минимальных количеств у животных, зараженных прионами, в инкубационном и раннем клиническом периодах болезни, в культурах клеток, сыворотках крови и других биологических жидкостях, приобретает особую значимость. Учитывая, что адаптирован к развитию кроме нервной ткани, в лимфоцитах, фолликулярных дендритных клетках, рядом авторов предложены методы доклинического выявления прионов иммуногистохимическим методом в миндалинах, а также в лимфатических узлах конъюнктивы глаза овец О . i А, i , , . В России Вольпиной О. Рыбаковым С. С. и др. Рыбаковым С. С., Решетниковым Г. Г. и др. животных. Необходимо также тестировать культуры клеток, полученные из органов и тканей сельскохозяйственных животных овец, крупного рогатого скота и используемых в биотехнологии и вирусологии, на присутствие прионов, а также создание клеточных линий, чувствительных к агенту скрепи, в качестве биопробы, наряду с лабораторными животными, и изучения различных аспектов взаимодействия прионов с клеткой. Цель получить поликлональные антитела к синтетическим пептидам прионного белка и проверить их специфичность к клеточной и инфекционной изоформам прионного протеина. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Исследования проведены с использованием синтетического пептида прионного белка с аминокислотной последовательностью 64 по бычьему пептиду на лабораторных животных мышах и кроликах. В работе использовались мутантные культуры клеток, хранящиеся в Криобанке ВИЭВ. НАУЧНАЯ НОВИЗНА Получены поликлональные антитела на синтетический пептид прионного белка с аминокислотной последовательностью 64 по бычьему пептиду. Определена способность иммунной поликлональной кроличьей сыворотки выявлять инфекционный прион в гистосрезах головного мозга животных, больных ТГЭ и культурах клеток, инфицированных агентом скрепи. Впервые получены межвидовая гибридная культура спленоциты овцы х лимфоциты кролика ПО ТК х ЛК и мышиная гибридома, продуцирующие моноклональные антитела к пептиду прионного белка. Культура ПО ТКх Ж чувствительна к вирусам инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота и вирусной диареи болезни слизистых крупного рогатого скота. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ Специфические кроличьи антитела к прионовому пептиду способны выявлять прионы в культурах клеток и гистосрезах головного мозга. Получена гибридная культура почка овцы х лимфоциты кролика, чувствительная к вирусам ИРТ и ВДБС КРС заявка на патент принята Г, ГСП5 г. Получение поликлональных иммунных кроличьих сывороток к пептиду прионного белка. ТГЭ с применением иммунной поликлональной кроличьей сыворотки. Получение, культуральноморфологическая и кариологическая характеристика гибридной культуры почки овцы и лимфоцитов иммунного кролика. Изучение ее чувствительности к вирусам инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, вирусной диареи болезни слизистых, парагриппа3, респираторносинцитиальной инфекции и их цитопатогенного действия. АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на Международной научнопрактической конференция I лет на передовом рубеже ветеринарной науки. Харьков, Международной научной конференции Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных, Подольск, Научной конференции, посвященной 0 летию основания Санкт Петербурга Биологическая, медицинская и ветеринарно медицинская наука и новейшие технологии на благо человека и человечества. СанктПетербург, г. Международной научной конференции Развитие ключевых направлений сх науки в Казахстане селекция, биотехнология, генетические ресурсы г. Астана, г на ом Международном конгрессе Европейского общества тканевых культур , г. Мюнстер г международной научной конференции Сохранение генетических ресурсов г. СанктПетербург, г. Международной научной конференции Ветеринарная медицина г. Ялта, г на межлабораторном совещании ВИЭВ, г. ПУБЛИКАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ По теме диссертации опубликовано 8 работ.