Разработка биотехнологической схемы получения препарата гетерологичного антирабического иммуноглобулина на основе F(ab`)2-фрагментов

• Автор: Генералов, Сергей Вячеславович
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 144 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Иммуноглобулиновые профилактические препараты классификация и

технологии получения.

Глава 2. Основные принципы получения иммобилизованных

ферментов

2.1. Типы носителей, применяемых для иммобилизации ферментов

2.2. Методы иммобилизации ферментов

2.3. Влияние иммобилизации на биохимические свойства ферментов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 3. Материалы и методы исследования.

3.1. Реактивы и растворы.
3.2. Оборудование и приборы
3.3. Методы иммобилизации ферментов
3.4. Штаммы микроорганизмов
3.5. Биохимические, биофизические, иммунологические и иммунохимические методы исследования
3.5.1. Определение протеолитической активности пепсина.
3.5.2. Определение и термостабильности пепсина
3.5.3. Определение концентрации белка
3.5.4. Определение прозрачности п цветности препарата ГаЬ2 фрагментов ангирабического иммуноглобулина
3.5.5. Определение белкового состава методом электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы
3.5.6. Определение белкового состава методом электрофореза в ПАЛГ
3.5.7. Догиммуноанализ
3.5.8. Испытание на токсичность
3.5.9. Реакция нейтрализации на белых мышах
3.5 Реакция активной анафилаксии.
3.6. Лабораторные животные.
3.7. Статистические методы.
Глава 4. Получение иммобилизованного фермента пепсина
4.1. Выбор оптимального способа иммобилизации пепсина
4.2. Изучение активности иммобилизованного фермента
4.3. Изучение стабильности иммобилизованного пепсина.
4.3.1. и термостабпльность.
4.3.2. Стабильность фермента при хранении
4.3.3. Операционная стабильность.
Глава 5. Разработка технологии получения Ра1У2фрагментов антирабического иммуноглобулина с помощью гетерогенного катализа
5.1. Выбор основных параметров ферментативного гидролиза АИГ.
5.1.1. Выбор температурного режима ферментативного гидролиза АИГ.
5.1.2. Выбор реакционной среды
5.1.3. Исследование количества добавляемого иммобилизованного фермента на степень гидролиза АИГ.
5.1.4. Выбор временного интервала этапа ферментативного гидролиза
5.2. Хроматографическое фракционирование РаЬ2фрагментов АИГ
5.3. Концентрирование препарата РаЬ2фрагментов АИГ.
5.4. Контроль физикохимических показателей препарата РаЬг фрагментов
Глава 6. Исследование иммунологических свойств РаЬ 2фрагмеытов гетерологичного антирабического иммуноглобулина
6.1. Исследование протективных свойств РаЬ2фрагментов АИГ
6.2. Определение токсигенных свойств препарата РаЬ2фрагментов АИГ
6.3. Исследование реактогенных свойств препарата РаЬ2фрагментов АИГ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ
Список сокращений
АИГ антирабический иммуноглобулин
уАПТС уаминопропилтриэтоксисилан
АНагароза соаминогексилагароза
ВОЗ Всемирная организация здравоохранения
ДИА дотиммуноанализ
международная единица
ОСО отраслевой стандартный образец
ПААГ полиакриламидный гель
СОП стандартный образец предприятия
бычий сывороточный альбумин
летальная доза для животных
додецилсульфат натрия
Введение


РаЬ2фрагменты элюировали вторым пиком без примесей низкомолекулярных пептидов и гтерасщепленных молекул иммуноглобулина. Элюцию проводили 0, М ацетатным буфером 5,5 на колонке размером 5,0 х см со скоростью 4 млмин. Для концентрирования препарата подобраны условия лиофильного высушивания. Высушивание проводили в течение часов, начальная температура материала составляла минус С, давление в камере Па, температура испарителя минус 2С. Полученный препарат на основе РаЬ2фрагментов нетоксичен, его специфическая активность не уступает таковой нерасщеплниого иммуноглобулина, при этом реактогенные свойства менее выражены. По результатам проведенных научных исследований разработаны методические рекомендации Получение РаЪ2фрагментов антнрабического иммуноглобулина в лабораторных условиях. Методические рекомендации одобрены Учным советом РосНИПЧИ Микроб протокол 2 от апреля г. Разработанная схема с использованием ферментолиза гетерологичного антирабического иммуноглобулина при С и 4,,5 в течение часов и хроматографического фракционирования на геле 8Р8ерЬагоеХЬ позволяет получать антирабический препарат, представляющий собой монофракцию РаЬфрагментов антител. Препарат РаЬ2фрагментов антирабического иммуноглобулина соответствует нормативным физикохимическим параметрам, предъявляемым к коммерческому препарату гетерологичного антирабического иммуноглобулина содержанию белка, прозрачности, цветности, электрофоретической однородности. Уровень вируснейтрализующей активности экспериментальных образцов препарата РаЬфрагментов равен таковому коммерческого препарата гетерологичного антирабического иммуноглобулина. Препарат на основе РаЬ2фрагментов антирабического иммуноглобулина не обладает анафилактогенными свойствами. Работа выполнена в отделе профилактических препаратов РосНИПЧИ Микроб в рамках темы НИР Разработка и внедрение в производство новых медицинских иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики возбудителей опасных инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной природы шифр 5. СНГ Материалы Волгоград, Всероссийской научнопрактической конференции Вакцииология . Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней Москва, . ВАК РФ. Диссертация состоит из введения, двух глав обзора литературы, четырех глав собственных исследований, включающих описание материалов и методов исследований и экспериментальную часть, заключения, выводов, списка литературы, содержащего 2 источников, из них зарубежных 0. Объм диссертации составляет 4 страниц машинописного текста, включает рисунков и 5 таблиц. Глава 1. В настоящее время среди мер, применяемых для профилактики и лечения ряда инфекционных заболеваний, большое значение придатся иммуноглобулиновым препаратам. Их можно классифицировать по способу введения, по форме выпуска, по специфичности и составу. Наиболее известны две группы препаратов для внутримышечного и внутривенного применения. Их выпускают как в жидком, гак и в сухом виде. Эти же препараты можно применять и другими способами перорально, интраперитонеально. Предложены схемы введения иммуноглобулинов при заболеваниях легких и верхних дыхательных путей ингаляции с использованием ультразвукового или компрессионного распылителя. Существуют готовые лекарственные формы препаратов, предназначенные для перорального, ректального и вагинального применения. Они выпускаются в виде таблеток, капсул, мазей, суппозиториев, аэрозолей. Современные коммерческие препараты иммуноглобулина содержат в свом составе более I. Существуют препараты, обогащенные I, I, альфаинтерфероном, а также препараты, состоящие из и 2фрагментов I . По специфичности действия различают нормальный и различные специфические препараты иммуноглобулина. Нормальный иммуноглобулин производят из крови большого числа индивидуальных доноров, он содержит весь спектр антител, присутствующих в популяции. Препарат нормального иммуноглобулина можно применять для профилактики и лечения широкого спектра заболеваний гепатита А, ветряной оспы, краснухи, коклюша, дифтерии и т.