Получение мутантных (ПО-ТК- ) и внутривидовых гибридных культур клеток овцы (ПО-ТК- х ЛО и ПО-ТК- х СО), их культурно-морфологические и кариологические свойства, чувствительность к вирусам и агенту скрепи

• Автор: Симонова, Алла Сергеевна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 144 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ

1. Список сокращений

2. ВВЕДЕНИЕ

3. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

3.1. Гибридизация соматических клеток животных, перспективы использования гибридных клеток в биотехнологии и вирусологии

3.2. Цитопатогенное действие вирусов в культурах клеток

3.2.1. Вирус инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота ИРТИПВ

3.2.2. Вирус парагриппа ПГ3

3.2.3. Вирус ринопневмонии лошадей РПЛ

3.2.4. Вирус диареиболезни слизистых к.р.с.

3.3. Прионные болезни и культуры клеток для изучения

агента скрепи
4.СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.
4.1. Материалы и методы
4.2. Результаты исследований
4.2.1. Культурально морфологические и кариологические свойства клеточной линии ПО2
4.2.2. Получение и изучение культуральноморфологических свойств мутантных штаммов клеток ПОТК
4.2.3.Получение гибридных культур ПОТКхСО почка овцы х спленоциты овцы и ПОТКхЛО почка овцы х лимфоциты
4.2.4. Культуральноморфологические и кариологические свойства гибридных культур
4.3. Изучение чувствительности культур клеток к вирусам
4.4. Изучение взаимодействия гибридных и мутантных линий клеток с агентом скрепи
4.4.1. Иммуноцитохимический анализ с использованием специфических первичных антител и вторичных антивидовых антител меченых щелочной фосфатазой и пероксидазой хрена
4.4.2. Электронномикроскопическое изучение мутантных и
гибридных клеток инфицированных агентом скрепи РгР5С
5. ОБСУЖДЕНИЕ
6. ВЫВОДЫ
7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
8. ЛИТЕРАТУРА
9. ПРИЛОЖЕНИЕ
Список сокращений
спэв
ПО2 ПОТК ПОТКхЛО
ПОТКхСО
ТР ПЭК Г1Т
лэк кст
НГУК
полиэтиленгликоль
клеточная линия почки эмбриона свиньи
гибриды клеток СПЭВА4ТК с лимфоцитами лошади
культура клеток почки овцы
мутантная культура клеток почки овцы
внутривидовая гибридная культура клеток
почки овцы с лимфоцитами овцы
внутривидовая гибридная культура клеток почки овцы со спленоцитами овцы
трахея эмбриона коровы
почка эмбриона коровы
почка теленка
легкие эмбриона коровы
клетки сердца теленка
тестикулы бычка
невринома гассерова узла крысы
5БДУ 5бром2дезоксиуридин
ТК тимидинкиназа
ГФРТ гипоксантингуанинфосфорибозилтрансфераза
ГАТ селективная среда, содержащая гипоксантин,
аминоптерин, тимидин ДМСО диметилсульфоксид
Кон А конканавалин А
Среда Игла МЕМ минимальная среда Игла РгРс изоформа нормального прионового протеина
РгРс изоформа инфекционного прионового протеина
МКА моноклональные антитела
ФГА фитогеммагглютинин
РПЛ вирус ринопневмонии лошадей
КЧС вирус классической чумы свиней
ПГ 3 вирус парагриппа 3 крупного рогатого скота
ТЦДКЛ тканевая доза, вызывающая цитопатогенный
эффект клеток в расчете на 1 клетку
ГЭ губкообразная энцефалопатия
1 иммуноглобулины
ИРТ вирус инфекционного ринотрахеита крупного
рогатого скота
КРС крупный рогатый скот
РРСС респираторнорепродутивный синдром свиней
1. ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Получить внутривидовые гибридные культуры клеток овцы путем слияния дефектных по ТК клеток ПОТК с лимфоцитами и спленоцитами овцы и изучить их биологические свойства. Изучить культуральноморфологические свойства и стабильность кариотипа мутантных и гибридных культур в динамике культивирования. Изучить чувствительность полученных культур клеток к некоторым вирусам и агенту скрепи, а также цитопатогенное действие указанных патогенов. Изучены культуральноморфологические и кариологические свойства перевиваемой клеточной линии ПО2 из криобанка ВИЭВ, использованной для селекции мутантных по ТК клеток и получения гибридных культур. Определена, пролиферативная и митотическая активность и динамика размножения клеток в культуре. Впервые, методом многошаговой селекции получены дефектные по ТК клеточные штаммы из перевиваемой линии клеток почки овцы ПО2 и изучены их биологические свойства. Показана пригодность мутантных штаммов ПО ТК для внутривидовой гибридизации соматических клеток овцы. Впервые получены гибридные штаммы клеток с лимфоцитами ПОТК хЛО и спленоцитами ПОТКхСО овцы и изучены их культуральноморфологические и кариологические свойства. Установлена чувствительность мутантных штаммов клеток ПОТК к вирусам ринопневмонии лошадей титр вируса составил Ю6 0 ТЦД мл. Ю6,57,0 ТЦД м,. Гибридные линии клеток ПОТКхЛО и ПОТКхСО чувствительны к вирусу инфекционного ринотрахеита 35 и Ю6,0ТЦД мл соответственно и к возбудителю ринопневмонии лошадей, титр вируса 5,5 ТЦЦ мл в обеих культурах. К вирусу диареиболезни слизистых мутантные ПОТК и гибридные ПОТК хСО штаммы клеток овцы оказались нечувствительными, культура ПО2 и гибридный штамм ПОТКхЛО малочувствительны. Гибридные культуры клеток ПОxI и ПОТКхСО оказались чувствительны к латентному герпесвирусу, штамм v крупного рогатого скота титр вируса составил 4,5 и Ю5,0 ТЦЦ Мл. Установлена чувствительность мутантных и внутривидовых гибридных культур клеток к агенту скрепи , выявлено цитопатогенное действие возбудителя скрепи в культурах. Практическая значимость работы. Полученные новые мутантные линии клеток почки овцы ПОТК и внутривидовые гибридные культуры клеток с лимфоцитами ПОТКхЛО и спленоцитами ПОТКхСО овцы, пригодные для вирусологических и биотехнологических исследований. Новый мутантный и гибридный штамм депонированы в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических культур клеток сельскохозяйственных и промысловых животных ВИЭВ СХЖ РАСХН, входящей в состав Всероссийской коллекции клеточных культур. Мутантная линия клеток почки овцы vi i . ПО0 ТК для гибридизации клеток животных i vi. vi i для вирусологии и биотехнологии, под ,. На основе полученных результатов в соавторстве разработаны Методические рекомендации по выявлению прионов в культурах клеток с использованием моноклональных антител. Изд. РАСХН. М., , стр. Авторы Дьяконов Л. П., Дагданова . ., Куликова И. Л., Гальнбек Т. В., Симонова . ., Шубин В. А., Санджаев Д. Апробация результатов исследований. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на научной конференции Научные основы производства ветеринарных биопрепаратов М. Международной научнопрактической конференции Консервация генетических ресурсов, г. Пущино, на м конгрессе Европейского общества тканевых культур, Гранада, Испания, на Международной научнопроизводственной конференции Биология клетки в культуре, СанктПетербург, на Ученом Совете ВИЭВ, на межлабораторном совещании ВИЭВ, апрель, г. Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 7 работ. Получение, культуральноморфологическая и кариологическая характеристика мутантных по гену тимидинкиназы ТК и внутривидовых гибридных культур клеток с лимфоцитами и спленоцитами овцы. Изучение чувствительности мутантных и гибридных культур к вирусам инфекционного ринотрахеита, латентного герпесвируса штамм v, парагриппа3, диареиболезни слизистых крупного рогатого скота, ринопневмонии лошадей и их цитопатогенного действия.