Новая облигатная метилотрофная бактерия Methylophilus sp. В-7741 как продуцент дейтрированной биомассы и экзополисахарида

• Автор: Нево Суфо Ален Нарсис
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 102 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА .

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Применение дейтерированных соединений и методы их получения

1.1.1. Применение дейтерированных соединений

1.1.2. Методы получения дейтерированных БАС.

1.2.Влияние оксида дейтерия на рост, биохимию и физиологию

микроорганизмов.

1.2.1. Сравнительный анализ физикохимических свойств 1Н и 2Н.
1.2.2. Влияние Н на рост и морфологию микроорганизмов, феномен клеточной адаптации к 2Н
1.2.3. Влияние 2Н на скорость ферментативных реакций и метаболизм углерода
1.2.4 Влияние 2Н на метаболизм нуклеиновых кислот, экспрессию генов и
генетический контроль.
1.2.5. Влияние 2Н на физиологию микроорганизмов.
1.3. Связь клеточного ответа на 2Н и другие стрессовые факторы
1.3.1. Перекрестная адаптация к стрессам у микроорганизмов
1.3.2. Участие экзометаболитов внеклеточных факторов в адаптации клетки
к стрессам
1.4. Метилотрофные бактерии как объекты изотопной биотехнологии.
1.4.1 Основные свойства метилотрофных бактерий
.1.1. Особенности метилотрофных бактерий
1.4.1.2. Характеристика первого и ключевого фермента ассимиляции метанола у метилотрофных бактерии метанолдегидрогеназы.
1.4.2. Биотехнологический потенциал метилотрофных бактерий
1.4.2.1. Экзополисахариды метилотрофных бактерий
1.4.4.2. Генетическое исследование метилотрофных бактерий.
1.4.3. Получение дейтерированных БАС с использованием метилотрофных бактерий .
ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
2.1. Влияние дейтерометанола и оксида дейтерия на кинетику роста облигатных метилотрофных бактерий i . В.
2.1.1. Определение кинетических параметров роста i . В
в средах различного изотопного состава
2.1.2. Влияние содержания дейтерометанола в субстрате на рост i .
2.1.3. Влияние ступенчатой адаптации бактерий i . В к 2Нсодержащим средам на продолжительность лагфазы, ртах и Уд,
2.1.4. Определение оптимальных условий температуры и р2Н для
роста бактерий i . В в дейтерированных средах
2.2. Оксид дейтерия как стрессовый фактор у i . В.
2.2.1. Влияние условий выращивания посевного материала на параметры роста в дейтерированной среде.
2.2.2. Определение активности каталазы в клетках, выращенных в обычной и дейтерированной среде.
2.2.3. Изучение биологического действия дейтерированной бесклеточной жидкости на рост i . В в дейтерированной среде.
2.3. Влияние дейтерирования на активность МДГ i . В
2.3.1. Активность МДГ в экстракте Н и 2Нбиомассы i . В.
2.3 .2. Изучение изотопного эффекта субстрата в реакции, катализируемой
МДГ i . В
2.3.3. Изучение изотопного эффекта растворителя в реакции, катализируемой
МДГ i . В
2.3.4. Изучение влияния на активность МДГ в экстракте Н и Нбиомассы i . В
2.4. Влияние дейтерия на биосинтез ЭПС у i . В.
2.4.1. Влияние питательных сред с разными уровнями содержания
дейтерия на биосинтез ЭПС.
2.4.2. Влияние температуры и на биосинтез ЭПС в Н и 2Нсреде.
2.5. Исследование углеводного состава ЭПС и определение степени
включения дейтерия в ЭПС
2.5.1. Выделение и очистка ЭПС i . В.
2.5.2. Гидролиз ЭПС i . В и определение
углеводного состава гидролизата хроматографическими методами
2.5.3. Изучение углеводного состава гидролизата ЭПС
Ме1Иу1орИИия Бр. В методом Н и ,3СЯМР спектроскопии.
2.5.4. Определение степени включения дейтерия в ЭПС при выращивании
ЬЛе пу1орЫ1из ър. В в максимально дейтерированной среде.
ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
3.1. Материалы.
3.1.1. Микробиологический объект.
3.1.2. Реагенты
3.1.3. Приборы.
3.1.4. Питательные среды для культивирования Ме1Иу1орИИиз зр. В.
3.2. Методы
3.2.1. Культивирование бактерий МеЬу1орЫ1ш Бр. В.
3.2.2. Ступенчатая адаптация бактерий Ме1Иу1орИИи.ч эр. В к средам, приготовленным на основе 2НгО
3.2.3. Приготовление посевного материала, адаптированного к осмотическому и окислительному стрессу.
3.2.4. Определение ростовых параметров.
3.2.5. Получение бесклеточных КЖ.
3.2.6 Определение концентрации экзополисахарида
3.2.7. Приготовление клеточного экстракта из Н и 2Нбиомассы.
3 2.8. Определение содержания белка в клеточных экстрактах по методу
3.2.9. Определение активности каталазы
3.2 Определение активности МДГ.
3.2.И. Частичный гидролиз в 0,1 н ТФУ
3.2 Полный гидролиз в 2 н ТФУ
3.2 Получение 1,2,3,4,6пентаОацетилрОглюкопиранозы.
3.2 Ацетилирование гидролизата дейтерированного ЭПС
3.2 Анализ состава гидролизатов методом ТСХ, БХ, и ВЭЖХ
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Важной проблемой биосинтеза дейтерированных соединений является токсичность дейтерированной воды как одного из основных источников дейтерия. Целый ряд вопросов, которые касаются практического использования различных штаммовпродуцентов БАС для роста и биосинтеза целевых продуктов в высокодейтерированных средах, остаются до конца невыясненными изза сложности их адаптации к оксиду дейтерия. Решение этой проблемы позволит резко увеличить возможности биосинтетического метода получения дейтерированных БАС. Механизм и закономерности процесса адаптации и роста бактерий, в том числе метилотрофных, в высокодейтерированных средах средах с высокими концентрациями оксида дейтерия и дейтерометанолом не вполне понятны, хотя биологические эффекты дейтерия подробно изучались. В связи с этим, изучение биохимических и физиологических особенностей роста и биосинтеза в тяжелой воде у микроорганизмов продолжает быть актуальной задачей как для получения различных дейтерированных соединений, так и в плане изучения биологически важного феномена адаптации к оксиду дейтерия. Многие метилотрофные бактерии характеризуются способностью секретировать внеклеточные полисахариды ЭПС. БАС, так и прямо в различных биомедицинских исследованиях. Целью настоящей работы было изучение особенностей роста метилотрофных бактерий и биосинтеза ЭПС при замене метанола на дсйтерометанол и воды на оксид дейтерия в культуральной среде с использованием в качестве модели новых облигатных метилотрофных бактерий 4i эр. Изучение влияния дейтерометанола и оксида дейтерия на ростовые характеристики облигатных метилотрофных бактерий i эр. Изучение возможности перекрестной адаптации к дейтерированной среде и другим стрессам осмотическому и окислительному, а также изучение возможности участия внеклеточных факторов в процессе адаптации к дейтерированной среде. Изучение влияния дейтерирования на активность МДГ МеуЬрИИиБ эр. Изучение дейтерирования ростовой среды на биосинтез ЭПС у МеМуЬрЬИш Бр. Выделение и изучение углеводного состава ЭПС определение степени включения дейтерия в этот биополимер при максимальном дейтерировании ростовой среды. ГЛАВА 1. Применение дейтерированных БАС в биомедицинских и фармацевтических исследованиях. Дейтсрированные органические вещества можно детектировать с большой точностью с помощью массспектрометрии, ЯМР, и других изотопночувствительных методов. Кроме того, чувствительность детектирования дейтерированных веществ гораздо выше но сравнению с детектированием веществ, меченных другими стабильными изотопами, такими как 3С и Ы 1. Известно, что дейтерированные БАС обладают крайне низкой токсичностью особенно по сравнению с веществами с радиоактивной меткой, поэтому дейтерированные вещества очень широко используются при изучении метаболизма питательных веществ, лекарств и токсичных соединений в организме человека и животных. Так, при изучении метаболизма глюкозы у дрожжей 2, серина и лейцина в организме человека 3, перлолирина в организме крысе 4 и флуорена в организме человека 5 были использованы дейтерированные аналоги этих БАС. Также при исследовании биосинтеза фосфатидилхолина у дрожжей были использованы дейтерированные аналоги метионина и холина 6. Вегманн с соат. Ьтриптофана, используя дейтерированный Ьтриптофан и дейтерированный ЫацетилЬтриптофан 7. Интересно, что дейтерированные формы лекарственных средств обладают иными фармакологическими свойствами по сравнению с недейтерированными формами. Вензел показал 8, что дейтерированные амфетамины проникают в головной мозг мышей и крыс быстрее, чем недейтерированные формы тех же веществ. Чаще всего изменение фармакологического действия лекарственного вещества происходит за счет изменения его метаболизма. Ключевым этапом во всех реакциях, катализируемых системой цитохрома Р0 печени, является разрыв СНсвязи. Вещества, у которых СНсвязь заменена на связь С2Н, обнаруживают большую устойчивость к расщеплению с помощью цитохрома Р0 Устойчивость подобных соединений к расщеплению может приводить к удлиннению времени фармакологического действия вещества.