Влияние регуляторных элементов и структуры кодонов на экспрессию бактериальной формиатдегидрогеназы в клетках E. coli

• Автор: Савицкий, Павел Александрович
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 136 с.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
NAD+ - никотинамидадениндинуклеотид окисленный
NADH - никотинамидадениндинуклеотид восстановленный
NADP+ - никотинамидадениндинуклеотидфосфат окисленный NADPH - никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный ФДГ - формиатдегидрогеназа
АТФ - аденозин-5 -трифосфат
dNTP - дезоксирибонуклеозид -5 -трифосфат
IPTG - изопропил-P-D-тиогалактозид
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
ДТТ - дитиотреитол
ОГЛАВЛЕНИЕ
Т. ВВЕДЕНИЕ
II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава 1. ЭКСПРЕССИЯ ЧУЖЕРОДНЫХ ГЕНОВ В КЛЕТКАХ E
ЕЕ Структура векторов Я. coli, обеспечивающих эффективную
экспрессию
1.2. Регуляция транскрипции
1.2.1. Промоторы
1.2.2. Терминаторы транскрипции
1.2.3. Антитерминаторы транскрипции
1.2.4. Системы экспрессии со строгой регуляцией промотора
1.3. Регуляция трансляции
1.3.1. Инициация трансляции мРНК
1.3.2. Усилители трансляции
1.3.3. Стабильность мРНК
1.3.4. Терминация трансляции
1.4. Внутриклеточная локализация экспрессируемых белков
1.4.1. Цитоплазматическая локализация
1.4.2. Секреция в периплазму
1.4.3. Секреция в среду культивирования
1.5. Частота использования кодонов в чужеродном гене и в клетках E. coli
1.6. Протеолиз экспрессируемых белков
1.7. Условия культивирования бактерий
Глава 2. СТРУКТУРА ГЕНА ФОРМИАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ И
ПРИЛЕГАЮЩИХ К НЕМУ ОБЛАСТЕЙ
III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Материалы
3.2. Методы исследования
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 4. ОПТИМИЗАЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА
ФОРМИАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ
4.1. Оптимизация экспрессии в системе TGl/pFDH6
4.2. Оптимизация структуры кодонов в гене формиатдегидрогеназы
4.3. Оптимизация рибосомсвязывающего участка
4.4. Оптимизация промоторного участка гена формиатдегидрогеназы
4.5. Оптимизация условий культивирования клеток A
BL2 l(DE3)/plysS/pFDH8
4.6. Увеличение стабильности суперэкспрессирующих формиатдегидрогеназу векторов
4.7. Объединение в одном векторе оптимизированных регуляторных элементов и оптимизированной структуры гена
V. ВЫВОДЫ
VI. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
I. ВВЕДЕНИЕ.
Бурное развитие в последние годы методов генетической инженерии позволило клонировать огромное количество генов различных белков из самых разных источников - от бактерий до млекопитающих. Это позволяет изучать белки на новом уровне, который был недоступен ранее: стало возможным изучение взаимосвязи структуры и функции белков, выявление их механизма действия, выяснение роли отдельных аминокислотных остатков в катализе, получение с помощью направленного мутагенеза мутантных белков. Однако, достаточно часто при попытках экспрессии клонированного гена в клетках E. coli не удается получить больших количеств целевого белка. Нередки случаи, когда клонированный белок вообще не синтезируется клетками E. coli. Ограничение уровня экспрессии может происходить на всех стадиях биосинтеза белка: транскрипции гена, трансляции матричной РНК и сворачивания полипептидной цепи в трехмерную структуру (фолдинга).
В нашей лаборатории ведутся работы с NAD-зависимой формиатдегидрогеназой (КФ 1.2.1.2., ФДГ) из метилотрофных бактерий рода Pseudomonas, окисляющей формиат-ион до С02 и при этом восстанавливающей NAD* в NADH. Этот фермент интересен как с теоретической, так и с практической точек зрения. С теоретической точки зрения этот фермент интересен тем, что является наиболее простым представителем суперсемейства дегидрогеназ 2-0-гидроксикислот. Реакция, катализируемая
формиатдегидрогеназой, самая простая среди всего семейства дегидрогеназ и может служить модельной при изучении механизма ферментативного переноса гидрид-иона от атома углерода субстрата к С4-атому гшкотинамидного кольца кофермента. С практической точки зрения формиатдегидрогеназа также чрезвычайно важна, так как является наилучшим ферментом для системы регенерации NADH. Реакция, катализируемая формиатдегидрогеназой, необратима, восстановление NAD+ можно проводить без его выделения из

использования гена устойчивости к ампициллину, поскольку секреция ß-лактамазы занимает часть ресурсов аппарата секреции [169].
1.4.3. Секреция в среду культивирования.
Секреция целевого белка в культуральную среду имеет свои преимущества (таблица 2). К сожалению, в норме клетки E. coli секретирутот во внеклеточное пространство всего несколько белков, а изменение свойств секреторных путей все еще представляет собой очень трудную задачу [170]. Методологически подходы к секреции в культуральную среду в E. coli могут быть разделены на две части: 1) использование существующих секреторных путей [171] и 2) использование специальных сигнальных последовательностей, химерных белков, пермеаз, химических веществ, влияющих на секрецию белков. Первый подход имеет то преимущество, что он обеспечивает специфическую секрецию целевого белка и не приводит к его загрязнению другими белками. Возможно, что наиболее известным примером является ген гемолизина, который использовался для конструирования секретируемых химерных белков [136,170]. Как известно, секреция не является высокоэффективным процессом и часть белка, который должен был быть секретирован, все равно остается в внутри клетки. Поэтому, второй подход состоит в изменении свойств внешней клеточной мембраны, увеличивающей ее проницаемость и в результате этого увеличивающей неспецифическую секрецию периплазматических белков в культуральную среду [138,172]. В качестве примера можно привести коэкспрессию белка, высвобождающего бактериоцин [173] и коэкспрессию гена kil [137]. В некоторых из этих работ было показано, что это действительно секреция белка в культуральную среду, а не следствие лизиса клеток, так как в культуральной среде не детектировалась активность цитоплазматической ß-галактозидазы. В общем, следует отметить, что выход белка при секреции в среду культивирования в E. coli достаточно низок.