Совершенствование биотехнологии производства сибиреязвенного диагностического бактериофага

• Автор: Солодовников, Борис Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.23, 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Ставрополь
• Количество страниц: 180 с. : ил

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Биологические свойства возбудителя сибирской язвы и проблемы, связанные с его идентификацией.
1.2. Сибиреязвенный бактериофаг состояние изученности, применение в лабораторной практике

1.3. Биотехнология производства сибиреязвенных диагностических бактериофагов

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы.

2.1.1. Штаммы микроорганизмов

2.1.2. Реактивы и питательные среды

2.2. Методы
2.2.1. Тесты для идентификации штаммов i i
2.2.1.1. Тест с сибиреязвенным бактериофагом.
2.2.1.2. Капсулообразование i vi у штаммов В. i
2.2.1.3. Тест жемчужное ожерелье.
2.2.1.4. Гемолиз эритроцитов барана
2.2.1.5. Тест на лецитиназу
2.2.1.6. Тест на щелочную фосфатазу
2.2.1.7. Определение протеолитической активности.
2.2.1.8. Определение токсинообразования i i i vi
2.2.2. Определение дополнительных питательных потребностей штаммов сибиреязвенного микроба
2.2.3. Определение плазмидного состава штаммов .i.
2.2.4. Определения концентрации живых спор сибиреязвенного
микроба
2.2.5. Определение вирулентности почвенных штаммов В.i
и их вариантов.
2.2.6. Определение концентрации фаговых частиц.
2.2.7. Определение потери в массе при высушивании препарата
2.2.8. Методы статистической обработки материала.
3. ВЫБОР ОБЪЕКТОВ БИОТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА СИБИРЕЯЗВЕННОГО ДИАГНОСТИЧЕСКОГО БАКТЕРИОФАГА .
3.1. Подбор производственных штаммов бактериофага и сибиреязвенного микроба кормилки. .
3.2. Оценка диапазона изменчивости природных штаммов возбудителя сибирской язвы.
3.3. Подбор индикаторных штаммов для определения концентрации фаговых частиц в препарате и контроля специфичности литического действия бактериофага Гамма А.
4. РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА ДИАГНОСТИ ЧЕСКОГО СИБИРЕЯЗВЕННОГО БАКТЕРИОФАГА ГАММА А НА ОБОГАЩЕННОЙ И СИНТЕТИЧЕСКОЙ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ.
4.1. Разработка состава жидкой обогащенной питательной среды и определение оптимальных условий культивирования на ней сибиреязвенного бактериофага.
4.2. Разработка состава жидкой синтетической питательной среды и определение оптимальных условий культивирования на ней сибиреязвенного бактериофага Гамма А
4.3. Оптимизация метода определения концентрации бактериофага .
5. СТАБИЛИЗАЦИЯ ЖИДКОГ О ДИАГНОСТИЧЕСКОГО СИБИРЕЯЗВЕННОГО БАКТЕРИОФАГА ГАММА А МЕТОДОМ ЛИОФИЛЬ НОГО ВЫСУШИВАНИЯ И ХАРАКТЕРИСТИКА СВОЙСТВ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ СЕРИЙ ПРЕПАРАТА
5.1. Отработка параметров лиофилизации сибиреязвенного бактериофага Гамма А, полученного на обогащенной и синтетической питательных
средах.
5.2. Разработка ускоренных режимов лиофилизации сибиреязвенного бактериофага Гамма А, полученного на синтетической питательной среде
5.3. Испытание литических свойств экспериментально производственных серий диагностического сибиреязвенного бактериофага Гамма А.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
ЛИТЕРАТУРА


Для получения четкой реакции фаголизиса необходимы оптимальные условия проявления фагом своих литических свойств, а также наличие индикаторных штаммов для определения концентрации фаговых частиц в препарате и контроля специфичности литического действия. Таким образом, разработка биотехнологий получения и производство сибиреязвенного бактериофага для восполнения дефицита этого диагностического препарата на Российском рынке, а также удовлетворение нужд отечественного здравоохранения являются насущной необходимостью. Цель и задачи исследования. Разработка биотехнологии производства высокоспецифичного диагностического сибиреязвенного бактериофага с длительным сроком годности. НД на разработанный препарат. Научная новизна. Впервые разработана биотехнология производства диагностического сибиреязвенного бактериофага Гамма А жидкого на обогащенной питательной среде патент на изобретение 3 Способ выращивания сибиреязвенного бактериофага Гамма от г. Впервые применен в качестве материнского штамма кормилки вакцинный штамм В. Ьгаск . Экспериментальные серии препарата сохраняли рабочую концентрацию бактериофага не ниже 2x9 БОЕмл и специфичность литического действия в течение гарантийного срока хранения 1 год при температуре от 2 до 8 С. Впервые разработана биотехнология производства диагностического сибиреязвенного бактериофага на жидкой синтетической питательной среде, стабилизированного методом лиофильного высушивания патент на изобретение 2 Способ получения сибиреязвенного бактериофага Гамма А от г. Разработанная биогехнология получения стабилизированного методом лиофильного высушивания сибиреязвенного бактериофага Гамма А с применением синтетической среды позволяет экономить дорогостоящие питательные среды, временные и энергетические ресурсы и получать высокоэффективный диагностический препарат. Экспериментальные серии препарата сохраняли рабочую концентрацию Ю9БОЕмл и специфичность литического действия в течение гарантийного срока хранения 3 года при температуре от 2 до 8С. Впервые изучен диапазон вариабельности вызывающих сложности при идентификации природных почвенных атипичных штаммов сибиреязвенного микроба по комплексу фенотипических признаков и генотипу, определен состав клеточной популяции штаммов по морфологическим и генетическим критериям, селекционированы стабильные клоны с разным фсно и плазмидотипом и выявлена чувствительность всех изученных вариантов античных штаммов к бактериофагу Гамма А. Практическая значимость. Ученым советом Ставропольского НИПЧИ и утвержденная директором института протокол 6 от г. Регламент производства бактериофага Гамма А диагностического сибиреязвенного жидкого сухого. Фармакопейная статья предприятия. Инструкция по применению бактериофага диагностического сибиреязвенного жидкого сухого. Налажено экспериментальное мелкосерийное производство бактериофага Г амма А. Апробация работы. Публикации. Основное содержание диссертации отражено в опубликованных статьях. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 0 страницах машинописного текста, содержит таблиц и рисунков, состоит из введения, 1 главы обзора литературы, 4 глав собственных исследований, включающих описание материалов и методов исследований и экспериментальную часть заключения выводов списка использованной литературы, включающего 9 отечественных и зарубежных источников. Биотехнология производства жидкого диагностического сибиреязвенного бактериофага Гамма А с использованием обогащенной питательной среды и определенных для нее оптимальных условий культивирования, позволяющие получить препарат с высокой концентрацией фаговых частиц. Биотехнология производства жидкого диагностического сибиреязвенного бактериофага Г амма А на синтетической питательной среде, обеспечивающая получение препарата бактериофага с высокой концентрацией фаговых частиц при экономии времени и средств. Стабилизация свойств жидкого диагностического сибиреязвенного бактериофага Гамма А методом лиофильного высушивания, позволяющая получить конечный продукт с требуемыми физикохимическими параметрами со сроком годности 3 года, со спектром литической активности и специфичности регидратированного препарата, не отличающаяся от таковой для жидкого бактериофага.