Совершенствование основных этапов технологии реконструирования яйцеклеток млекопитающих при использовании кариопластов и цитопластов различного происхождения и состояния

• Автор: Леонтьев, Алексей Александрович
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Боровск
• Количество страниц: 123 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Источники донорских ядер

1.2. Источники реципиентной цитоплазмы, факторы репрограммирования

1.3. Синхронизация клеточных циклов донорского ядра и реципиентной цитоплазмы.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

II. Объекты и методы исследований

2.1. Получение клеток источников цитопластов.

2.2. Получение клеток источников кариопластов

2.3. Реконструирование клеток

2.4. Слияние кариопластов с цитопластами.
2.5. Активация.
2.6. Культивирование.
III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Разработка способа энуклеации яйцеклеток и трансплантации в них кариопластов
3.2. Эффективность различных вариантов активации интактных ооцитов мышей с целью получения цитопластов для реконструирования клеток.
3.3. Получение культур клеток сперматогоний и фибробластов взрослых животных для использования их в качестве источников кариопластов
3.4. Электрослияние цитопластов с кариопластами разных размеров и различного происхождения
3.5. Эффективность реконструирования яйцеклеток мышей в зависимости от состояния цитопластов
3.6. Эффективность репрограммирования кариопластов, полученных из бластомеров 2клеточныхЧ1Ьшшных эмбрионов, в зависимости от стадии
их клеточного цикла.
ВЫВОДЫ.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Некоторые успехи в получении живого потомства при использовании в качестве кариопластов ядер соматических клеток взрослых животных достигнуты благодаря исследованиям влияния стадии клеточного цикла донорского ядра и цитопласта реципиента на развитие реконструированных клеток СатрЬеП К. Исходя из вышеизложенного, для повышения эффективности технологии клонирования, основанной на трансплантации ядер диплоидных клеток в энуклеированные яйцеклетки, исследования должны быть направлены на изучение процессов, происходящих при осуществлении каждого этапа технологии и на их совершенствование. Цель и задачи исследований. Целью исследований являлось изучение факторов лимитирующих процесс реконструирования яйцеклеток и на основе полученных результатов усовершенствовать основные этапы технологии клонирования млекопитающих. Научная новизна исследований. Впервые в исследованиях на мышах с точно фиксированным временем осеменения определены фазы клеточного цикла кариопластов, оптимальные для репрограммирования цитопластами, полученными из неоплодотворенных яйцеклеток. Установлено, что кариопласты, выделенные из бластомеров 2клеточных эмбрионов, находящихся в фазе клеточного цикла лучше репрограммируются цитопластами в реконструированных клетках, по сравнению с кариопластами, находящимися в фазах Б и б2 клеточного цикла. Впервые изучена возможность получения, сохранения в культуре и использования в качестве кариопластов, при реконструировании клеток, сперматогоний мышей и быков разного возраста. Выявлены факторы, лимитирующие процесс удаления хроматина из яйцеклеток млекопитающих и разработан эффективный способ энуклеации и реконструирования яйцеклеток. Впервые определены оптимальные режимы комбинированной химической активации яйцеклеток, позволяющие более четко визуализировать хроматин и полностью удалять его при получении цитопластов. Практическая значимость. Разработанный способ энуклеации и реконструирования яйцеклеток с использованием разреза в прозрачной оболочке может быть использован в биотехнологии клонирования для повышения эффективности реконструирования эмбрионов, так как обладает преимуществами перед известными способами по простоте и скорости исполнения, обеспечивает высокую сохранность оперируемых клеток. Комбинированные способы химической активации интактных ооцитов, включающие обработку цитохалазином Б, могут быть использованы с целью создания четкой картины расположения ядерного материала в ооцитах, и тем самым обеспечить полное его извлечение при энуклеации. Результаты исследований полученные при определении фаз клеточного цикла кариопластов, оптимальных для репрограммирования цитопластами, могут быть использованы в работах по получению клонированных млекопитающих. Модификации способа электрослияния комплекса сперматогония цитопласт могут быть с успехом использованы для электрослияния с цитопластом кариопластов соматических клеток малых размеров мкм. Разработанный способ энуклеации яйцеклеток, путем вырезания фрагмента блестящей оболочки, позволяет упростить и ускорить процесс реконструирования клеток и обеспечивает высокую сохранность оперируемых клеток. Разработанные комбинированные способы химической активации интактных яйцеклеток, позволяют четко визуализировать ядерный материал и обеспечивают его полное удаление из неоплодотворенных яйцеклеток при получении цитопластов. Кариопласты, полученные из бластомеров 2клеточных эмбрионов мышей, находящиеся в фазе в1 клеточного цикла, лучше репрограммируются цитопластами в реконструированных клетках, по сравнению с ядрами, находящимися в фазах Б и в2 клеточного цикла. Повышение контакта между кариопластом и цитопластом с помощью фитогемагглютинина и центрифугирования достоверно повышает эффективность электрослияния кариопластов малых размеров. Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на ежегодных отчтных сессиях ВНИИФБиП в период с по г. Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии. ВНИИ сельхоз. Москва, октября г. ДНК технологии в клеточной инженерии и маркировании признаков сельскохозяйственных животных. ВИЖ, Дубровицы, ноября г. Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных. ВИЖ, Дубровицы, ноября г.