Биосенсорные системы на основе бактерий-деструкторов ε-капролактама и их применение для экологического контроля и биотехнологических исследований

• Автор: Россинская, Ирина Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 127 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 Промышленное производство и потребление капролактама

1.2 Биологическая обработка отходов, содержащих капропактам и его олигомеры

1.3 Физикохимические методы определения г.

капролактама и его олигомеров в водных средах

1.4 Биохимические основы и генетический контроль деградации капролактама .

1.4.1 Влияние капролактама на живые организмы и параметры его токсичности

1.4.2 Микробиологическая деградация синтетических лактамов

1.4.ЗБашп ер иидеструшпоры капролактама

1.4.4 Микробный метаболизм капролактама

1.4.5 Ферменты биодеградации капролактама
1.4.6 Генетический контроль биодеградации капролактама плазмиды деградации
1.5 Биохимия микробиологической деградации линейных и циклических олигомеров капролактама
1.5.1 Биохимические пути и ферменты биодеградации олигомеров
1.5.2 Биодеградация циклического димера
аминогексаноата.
1.5.3 Приобретенная способность к деградации
олигомеров
1.6Микроорганизмыдеструшпоры синтетических
полимеров
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1 Биосенсорные измерения
2.1.1 Формирование рецепторного элемента
2.1.2 Юоветный способ регистрации сигнала
2.1.3 Проточноинжекционный способ регистрации сигнала
2.2 Калибровка биосенсора
2.2.1 Тонкослойная хроматография
2.2.2 Фотометрический метод
2.3 Определение удельной активности ферментной системы деградации капролактама
2.4 Практическое применение биосенсорных систем
2.4.1 Определение концентрации капролактама в образцах промышленных отходов
2.4.2 Оценка степени биодеградации капролактама в образцах промышленных отходов
2.5 Определение пути биотрапсформации олигомеров
2.5.1 Оценка способности бактериальных клеток к росту на олигомерах
2.5.2 Инкубация бактерийдеструкторов капролактама в присутствии олигомеров
2.5.3 Массспектрометрический анализ культуральной жидкости
2.6 Реактивы
2.7 Бактериальные штаммы и плазмиды
2.8 Питательные среды и условия культивирования
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 РАЗРАБОТКА ЛАБОРАТОРНОЙ МОДЕЛИ БИОСЕНСОРА КЮВЕТНОГО ТИПА НА ОСНОВЕ ШТАММОВ С РАЗЛИЧНЫМИ СОЧЕТАНИЯМИ САРПЛАЗМИДА БАКТЕРИАЛЬНЫЙ ХОЗЯИН, ПРИМЕНЕНИЕ ЕЕ ДЛЯ ЭКСПРЕССОЦЕНКИ ОКИСЛИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ БАКТЕРИЙ
3.1.1 Определение параметров градуировочных
зависимостей биосенсоров
3.1.2 Пределы обнаружениякапролактама биосенсорами
3.1.3 Линейные диапазоны градуировочных зависимостей биосенсоров
3.1.4 Выбор рабочих параметров микробного биосенсора
3.1.4.1 Выбор режима культивирования
3.1. Зависимость ответов биосенсора от содержания клеток в рецепторном элементе
3.1.4.3 Зависимость ответов биосенсора от среды
3.1.4.4 Зависимость ответов биосенсора от концентрации солей буферного раствора
3.1.5 Операционная стабильность биосенсора кюветного типа
3.1.6 Долговременная стабильность биосенсора кюветного типа
3.1.7Длительность единичного измерения биосенсора кюветного типа
3.1.8 Селективность биосенсора кюветного типа
3.2 ОПРЕДЕЛЕНИЕ УДЕЛЬНЫХ АКТИВНОСТЕЙ ФЕРМЕНТНЫХ СИСТЕМ ДЕГРАДАЦИИ КАПРОЛАКТАМА БАКТЕРИАЛЬНЫМИ ШТАММАМИ С РАЗЛИЧНЫМИ СОЧЕТАНИЯМИ ПЛАЗМИДАБАКТЕРИАЛЕНЫЙ ХОЗЯИН
3.3 СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ВЕЛИЧИН УДЕЛЬНОЙ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ ПЯТИ ВЫБРАННЫХ ШТАММОВ С ПАРАМЕТРАМИ ГРАДУИРОВОЧНЫХ ЗАВИСИМОСТЕЙ БИОСЕНСОРОВ
3.4 МАКЕТ МИКРОБНОГО СЕНСОРА ПРОТОЧНОИНЖЕКЦИОННОГО ТИПА ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ КАПРОЛАКТАМА, ЕГО СЕЛЕКТИВНОСТЬ, АНАЛИТИЧЕСКИЕ И МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
3.4.1 Построение градуировочной зависимости, определение аналитических и метрологических
характеристик биосенсора проточноинжекционного типа
3.4.2 Операционная стабильность биосенсора проточно инжекционного типа
3.2.3 Долговременная стабильность биосенсора
проточноинжекционного типа
3.5 СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БИОСЕНСОРОВ КЮВЕТНОГО И ПРОТОЧНОИНЖЕКЦИОННОГО ТИПА
3.6 ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БИОСЕНСОРНОГО АНАЛИЗАТОРА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ КАПРОЛАКТАМА В ПРОМЫШЛЕННЫХ ОТХОДАХ И ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОЧИСТНЫХ СООРУЖЕНИЙ
3.7 ИЗУЧЕНИЕ ПРОЦЕССА ТРАНСФОРМАЦИИ ЛИНЕЙНЫХ ОЛИГОМЕРОВ БАКТЕРИЯМИДЕСТРУКТОРАМИ КАПРОЛАКТАМА.
3.7.1 Оценка дыхательной активности бактерий в присутствии линейных олигомеров
3.7.2 Путь трансформации линейных олигомеров бактериальными клетками
3.7.3 Перспективы использования бактерийдеструкторов капролактама для биологической очистки олигомерсодержащих стоков
ЛИТЕРАТУРА
ПРИЛОЖЕНИЯ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ . i а i
С А Рплазм ида плазмида деградации капролактама
ПДК предельно допустимая концентрация
КОЕ количество колониеобразующих единиц
ЛДо показатель токсичности средняя доза, после поступления которой в организм в течение трех суток наступает гибель подопытных животных
XIIК химическое потребление кислорода
ВПК биохимическое потребление кислорода
ЦТК цикл трикарбоновых кислот цикл Кребса
Км константа Михаэлиса
ТСХ тонкослойная хроматография
Е единица активности фермента количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоль субстрата за 1 мин.
ВВЕДЕНИЕ


Первый подход к созданию биосенсора для детекции капролактама в водных средах представлен в работе Риделя i, где показана принципиальная возможность получения аналитических сигналов сенсора, основанного на иммобилизованных клетках штамма деструктора i К и кислородном электроде, при добавлении капролактама в измерительную ячейку 1. Способность к окислению капролактама у большинства штаммов бактерий рода контролируется конъюгативными плазмидами биодеградации капролактама САРплазмидами. Находясь в одном и том же бактериальном хозяине, они в значительной степени различаются по характеру регуляции процесса трансформации указанного ксенобиотика. Гетерогенность плазмид с точки зрения их функциональной экспрессии дает возможность конструирования практически полезных штаммов с повышенной способностью к разложению ксенобиотика. Использование микроорганизмов в биосенсорных системах предполагает предварительный отбор. Ранее немецкими исследователями была показана возможность проведения скрининга микроорганизмовдеструкторов ксенобиотиков при помощи биосенсорных технологий на основании оценки их дыхательной активности в присутствии потенциальных субстратов 2. Биосенсорный подход для экснрессоценки окислительной активности штаммов микроорганизмов,, в том числе с разным сочетанием бактериальный хозяин плазмида, является перспективным для исследований в области биотехнологии защиты окружающей среды. Вопрос о биотрансформации олигомеров капролактама изучен в меньшей степени. Описан ряд бактерий, утилизирующих линейные и циклические олигомеры капролактама, показана принципиальная возможность деградации найлона6,6 лигнинразрушающими грибами. Однако возможности применения микроорганизмов для биологической очистки сточных вод и отходов производств, содержащих олигомеры капролактама, а также для создания биосенсорных систем, в настоящее время только исследуется. ГЛАВА 1. Представленная к защите диссертационная работа выполнена на стыке нескольких научных отраслей биохимии и физиологии микроорганизмов, аналитической химии, биотехнологии. Исследование затрагивает целый ряд проблем, связанных с особенностями функционирования аналитических биосенсорных систем, экологическими аспектами производств капролактама и полиамида, биохимическими и генетическими закономерностями деградации этих соединений под действием микроорганизмов. В рамках данного литературного обзора освещены масштабы производства капролактама и полиамида, проанализированы используемые в настоящее время физикохимические методы определения капролактама и его олигомеров, рассмотрены такие вопросы как влияние капролактама на живые организмы, биохимические основы и генетический контроль биодеградации капролактама, олигомеров и полимерных материалов микроорганизмами. Промышленное производство и потребление капролактама Капролактам, применяемый при производстве полиамида, является одним из наиболее востребованных и широко используемых химических реактивов. Около товарного капролактама расходуется на производство полиамида найлон6. В свою очередь полиамида идет на получение волокон, остальное на получение конструкционных пластмасс и полиамидных пленок. Мировые мощности по производству капролактама в году составили 4,2 млн. В промышленности капролактам получают преимущественно из бензола рис. Рис. Схема получения капролактама из бензола Основными потребляющими сегментами мирового рынка капролактама являются производство волокон и нитей в г. По прогнозам сотрудников Самарского государственного университета, выполняющих научнотехнические работы по модернизации и развитию производств ОАО КуйбышевАзот 4, среднегодовой прирост производства за период гг. Суммарные годовые мощности по производству капролактама в СНГ на начало года составляли 6 тыс. На сегодняшний день на рынке СНГ действуют пять основных производителей капролактама АО КуйбышевАзот Россия доля производства в СНГ , Азот Кемерово Россия, Азот Гродно Беларусь, Щекиноазот Тульская обл. Россия и ОАО Азот Черкассы Украина. За период с по гг. СНГ составил ,5. В дальнейшем прогнозируется среднегодовой рост производства на уровне 2,9.