Антирестрикционная активность белков ArdA, ArsR, MerR

• Автор: Расторгуев, Сергей Михайлович
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 99 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Системы рестрикциимодификации ДНК

Номенклатура и классификация М систем.

Основные характеристики М систем Iго типа.

Семейства М систем Iго тина.

Ферменты Iго типа основные биохимические характеристики.

а Структура комплекса.

б Субъединица специфичности .

в Субъединица модификации .

г Субъединица рестрикции .
д Функционирование М комплекса Iго типа.
Биологическая роль М систем Iго типа.
Антирссгрикцня.
Феномен ослабления рестрикционной активности М систем Iго типа протеолитический контроль
Специфические системы антирестрикции
а Антирестрикционная активность бактериофагов.
б Антирестрикционная активность конъюгативных плазмид.
Белковая мимикрия ДНК i ii
и уцгонероны
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Бактериальные штаммы и бактериофаги.
Плазмиды.
Среды и буферы.
Выделение и очистка ДНК.
Измерение антиресгрикционной и антимодификационной активностей.
Идентификация белка в клетках . i.
УФоблучение бактерий.
Измерение биолюминесценции
Определение нуклеотидной последовательности
Сайтнаправленный мутагенез.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
I Регуляторные белки и ингибируют ферменты рестрикциимодификации Iго типа.
а Ослабление рестрикции Iго типа в . i 2 в присутствии плазмиды .
б Клонирование фрагментов Д1 I , ответственных за ослабление ЕсоКрестрикции.
в Определение нуклеотидной последовательности локуса . ответственного за ослабление аКрестрикции.
г Белкирегуляторы из 3 и V1 и белки из 2 и Тп ослабляют рестрикционную активность систем Iго типа.
д Белки и имеют общий антирестрикционный мотив с белками .
И Влияние аминокислотных замещений в белке I i на его антирестрикционную и антимодификационную активности.
а Влияние мутационных замещений в антирестрикционном мотиве I на его активность в качестве ингибитора системы рестрикциимодификации .
б Влияние мутационных замен в предполагаемой области межсубъединичного интерфейса на его функциональную активность.
III Активность систем Iго типа ослабевает в клетках . i К при УФоблучении и при действии шгрегулона Vii i.
а Ослабление рестрикции Iго типа при УФоблучении бактериальных клеток, или эффект V. Входят ли гены в состав регулона
б Ослабление активности системы Iго типа ЕсоУЛ под действием x
регулона Viiii.
IV Практическое применение генов для детекции ионов мышьяка.
а Конструирование гибридной плазмиды x 1.
б Конструирование гибридной плазмиды x2.
с Влияние арсенита на биолюминесценцию . i Ix и . i x2.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ Ш
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Конструирование гибридной плазмиды x2. Влияние арсенита на биолюминесценцию . Ix и . ЗАКЛЮЧЕНИЕ. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. ВВЕДЕНИЕ. Системы рестрикциимодификации играют важную роль в жизни бактериальной клетки. В основе явления рестрикциимодификации лежит сопряженное действие рестрикционной эндонуклеазы и ДНКметилтрансферазы. Ферменты рестрикциимодификации 1, II и Шго типов узнают специфическую последовательность в ДНК, и рестрикционная эндонуклеаза индуцирует в немодифицированной ДНК двойные разрывы. Для защиты собственной ДНК от рестрикционного расщепления используется специфическое метилирование узнаваемых последовательностей в ДНК, которое осуществляют ДНК метилтрансферазы. Рестрикция эффективна против чужеродной ДНК независимо от способа ее проникновения в клетку при инъекции из фаговой головки, при трансформации или при конъюгативном переносе. Таким образом, системы рестрикциимодификации клетки создают т. В природе горизонтальный перенос генов между бактериями осуществляется в основном с помощью конъюгативных плазмид и бактериофагов. Можно предположить, что в процессе эволюции как у плазмид, гак и у бактериофагов возникли системы, способствующие преодолению рестрикционных барьеров. У конъюгативных плазмид и ряда бактериофагов обнаружена способность преодолевать действие клеточных рестриктаз. Это явление получило название антирестрикции. Исследование антирестрикционных механизмов у конъюгативных плазмид показало участие в этом процессе специального белкаантирестриктазы, продукта гена, названного агА. Впервые гены агс агЖА и агс были обнаружены в плазмидах и I групп несовместимости рКМКН, СоЬР9, а затем в плазмидах других групп. В настоящее время показано, что гены агс1 играют важную роль в жизненном цикле конъюгативных плазмид, обеспечивая успешное преодоление рестрикционных барьеров при переносе ДНК из одного вида бактерий в другие. Объектами настоящего исследования являются АгбИ. МсгЯ, белкирегуляторы транскрипции аг. Аг1А, ген которой расположен в конъюгативной плазмиде рКМ1 тс1Ч. АгеЯ и МегЯ обладают антирестрикционной активностью, т. Настоящая работа посвящена поиску новых генов в трансмиссивных плазмидах, а также в транспозонах, продукты которых обладают свойствами антирестриктаз, т. Кроме того, исследована роль антирестрикционного мотива в функциональной активности антирестрикционного белка АгбА, ген которого расположен в трансмиссивной плазмиде рКМ1, группа несовместимости. Системы рестрикциимодификации системы М играют важную роль в жизни бактериальной клетки . В основе явления рестрикциимодификации лежит сопряженное действие рестрикционной эндонуклеазы и ДНКметилазы . Т. . Ферменты рестрикциимодификации I, II и 1Пго типов узнают специфические последовательности в ДНК i Т. Рестрикционная эндонуклеаза индуцирует в немодифицированной ДНК двойные разрывы. Для защиты собственной ДНК от рестрикционного расщепления в клетке используется специфическое метилирование узнаваемых последовательностей в ДНК, которое осуществляют ДКметилтрансферазы, сопряженные с рестрикционными эндонуклеазами. Рестрикция эффективна против чужеродной ДНК независимо от способа ее проникновения в клетку при инъекции из фаговой головки, при конъюгативном переносе или трансформации. Исследование явления рестрикциимодификации привело к открытию и широкому использованию рестрикционных эндонуклеаз Iго типа, осуществляющих специфическое фрагментирование ДНК, что явилось одним из решающих факторов, определивших развитие исследований в области генной инженерии i . Показано, что системы рестрикциимодификации оказывают влияние на такие клеточные процессы как генетическая рекомбинация, транскрипция, транспозиция. Существуют также системы рестрикции, которые атакуют Д1I, только в том случае, если мишень модифицирована. К ним относятся системы МсгА, МсгВС, ведущие деградацию ДНК, содержащую модифицированные азотистые основания i Е. А., i . Впервые рестрикционные системы были обнаружены в бактериях на основании данных по эффективности посева на различных штаммах . Тчетных бактериофагов i . М. i .