Молекулярно-генетический анализ кластера генов, контролирующих устойчивость к метилвиологену и фототаксис цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803

• Автор: Кирик, Инесса Анатольевна
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 110 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОВЗОР ЛИТЕРАТУРЫ б

Генетический контроль и молекулярные механизмы адаптации фотосинтезирующих органпзмоп к стрессовым факторам

1. Окислительный стресс и аитиоксидаитиыс системы защиты б

1.1. Условия развития окислительного стресса в клетках

аэробных организмов

1.2. Генетический контроль адаптивного ответа на окислительный стресс

у энтеробактерий

1.3. Генетический контроль устойчивости к окислительному стрессу

у растений
1.4. Системы адаптации к окислительному стрессу у цианобактерий
1.4.1. Изменения в тотальном профиле транскрипции у ii
при гидропероксидном стрессе
1.4.2. ре гул он ii
1.4.3. Изменения в тотальном профиле транскрипции в клетках ii
под действием генератора супероксида М V
1.4.4. Контроль устойчивости клеток ii к V с участием регуляторного гена и генов белковтранспортеров
2. Молекулярные механизмы адаптации цианобактерий к солевому
и гиперосмотнческому стрессу
2.1. Специфичность адаптивных ответов клеток ii па солевой
и гипсросмотический стресс
2.2. Перекрывание адаптивных ответов на солевой
и гипсросмотический стресс
2.3. Кинетика адаптивного ответа клеток i на солевой стресс
2.4. Регуляция адаптивного ответа клеток на солевой
и гиперосмотический стресс
3. Механизмы адаптации клеток ii к холодовому стрессу
4. Системы адаптации фотосинтезирующих организмов к световому стрессу
5. Генетический контроль фототаксиса и биогенеза нилей у ii
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Бактериальные штаммы и плазмиды
2. Питательные среды и культивирование микроорганизмов
3. Определение содержания хлорофилла и каротиноидов
в клетках цианобактерий
4. Трансформация клеток . i и ii
5. Передача плазмид из . i в ii с помощью конъюгации
6. Тест на чувствительность клеток к ингибиторам роста
7. Измерение активности галактозидазы в клетках ii
8. Выделение ДНК, определение числа копий плазмид в клетке
9. Обработка ДНК ферментами
. Электрофорез ДНК в агарозном геле и выделение ДНК из геля
. Полимеразная цепная реакция ПЦР
. Сайтиаправленный мутагенез
. Определение последовательности нуклеотидов в ДК
. Выделение РНК, электрофорез и перенос РНК из геля на нейлоновую
мембрану
. Получение специфических ДНКзондов
. Нозернблотгибридизация
. Анализ профилей транскрипции в клетках i
с помощью ДНКмикрочипов
. Атомносиловая микроскопия
РЕЗУЛЬТАТЫ II ОБСУЖДЕНИЕ
1. Анализ регуляторной функции гена с помощью сайтиаправлеипого мутагенеза и геноврепортеров
1.1. Сконцсвой участок необходим для функционирования белка
в качестве репрессора транскрипции
1.2. Системы анализа экспрессии и взаимодействия аллелей гена
1.3. Негативная авторегуляция гена в клетках . i
1.4. мсдомииантный характер проявления мутантного аллеля
в клетках i
2. Оперон вовлечен в адаптивный ответ клеток на солевой стресс
3. Плсйотропиый характер мутации повышенная устойчивость клеток к
V и отрицательный фототаксис, независимый от интенсивности света
4. Деления и инссрциопная инактивация гена не влияют на фототаксис
5. Зависимость подвижности клеток мутанта от спектра света
6. В регуляцию фототаксиса вовлечен ген , контролирующий
активируемый светом гетеротрофный рост клеток i
7. Изменения в регуляции генов, ответственных за функционирование пилей, у мутантов с нарушенной функцией гена
8. Анализ морфологии пилей, обеспечивающих подвижность клеток
i у у мутантов с нарушенным или измененным фототаксисом
8.1. Сравнительный анализ пилей, формируемых подвижными
и неподвижными клетками штаммов ДТ и ДТМ i
8.2. Гены и контролируют функционирование толстых пилей,
но не их биогенез
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Такая структура делает его мало реакционноспособным в отношении большинства органических соединений. Активация кислорода может происходить двумя различными путями либо в результате переворота спина одного из неспареиных электронов с образованием сииглетиого кислорода, С, либо при последовательном одиоэлектроином восстановлении триплетного кислорода до воды , , i . Восстановление 2 катализируется в клетке несколькими ассоциированными с мембранами ферментами дыхательной цепи Кулииский, , , I, . В результате образуются следующие ЛФК анионрадикап супероксида О2Л гидропероксид Н2О2 и гидроксильный радикал НО восстановление последнего приводит к образованию молекулы воды. Первая реакция с образованием Ог эндотермическая, последующие реакции этой цепи экзотермические рис. Анионрадикал супероксида может образовываться в результате автоокисления ферментов, таких как дегидрогсназы, сукцинаг дегидрогеназы, лактат дегидрогеназы, глутатион редуктазы, а также при автоокислении убихинонов, катехолов, тиолов и флавинов , , I, . У фотосинтезирующих организмов образование V может происходить в результате взаимодействия О2 с акцепторами электронов фотосистемы I, причем наиболее активно в условиях пониженного содержания окисленного , когда О2 становится преимущественным акцептором электронов от фотосистемы I реакция Мелера , см. Ог может вступать как в окислительные, так и в восстановительные реакции. Он окисляет серу, тиолы, аскорбиновую кислоту, , токоферол, катехоламины восстанавливает цигохром С и ионы металлов с переменной валентностью железо, медь , , I, . Протонированпая форма пергидроксильный радикал НОО является сильным окислителем, однако его биологическое значение при физиологических значениях невелико изза низкой концентрации ii, ii, . Таким образом, все АФК, за исключением экзогенного озона рис. I, . Основные источники образования АФК и мишени их действия приведены в табл. Рис. АФК синглетный кислород, озон и промежуточные продукты восстановления кислорода до воды , , . Основными мишенями действия АФК в клетке являются липиды, белки и нуклеиновые кислоты. Повреждения, индуцируемые в клетке АФК, разнообразны при окислении нуклеиновых кислот образуются модифицированные азотистые основания, анурииовые бреши и разрывы сахарофосфатного остова, а при окислении белковых молекул метиоиннсульфоксиды, внутри и межмолекулярные дисульфидныс связи между цистеиповыми остатками и некоторые другие нарушения I, . Анионрадикал супероксида легко восстанавливает транзитные металлы такие как медь и железо и спонтанно дисмутирует в перекись водорода, что создаст условия образования наиболее токсичного гидроксильного радикала в реакции Фентона, или ГабераВейса. Сииглстный кислород, озон и свободные кислородные радикалы способны окислять молекулы ненасыщенных жирных кислот в липидах мембран, инициируя цепную реакцию псрекисиого окисления липидов рис. Выделяют три стадии окисления липидов, которые называют инициированием, продолжением и обрывом цепи. Цепная реакция инициируется при внедрении в липидный слой мембран или лнпопротеииов свободного радикала, чаще всего НО на рис. НОг. Будучи небольшой незаряженной частицей, НО легко проникает в толщу гидрофобного липидного слоя и вступает в химическую реакцию с иолиненасыщенными жирными кислотами . При этом образуются липидные радикалы . На стадии продолжения липидный радикал вступает в реакцию с растворенным в среде молекулярным кислородом, в результате чего образуется липопероксидный радикал , или ЬОг. Последний реагирует с соседней молекулой липида с образованием гидропероксида липида, называемого также гидропероксидом жирной кислоты , или 2, и нового липидного радикала i . Обрыв цепной реакции происходит при взаимодействии липидных радикалов с антиоксидантами, ионами металлов переменной валентности или друг с другом. В качестве побочного продукта при одиоэлектронном восстановлении гидропероксида липида может образовываться алькоксирадикал рис. Перекисное окисление липидов сопровождается нарушениями в свойствах биологических мембран и функционировании клеток.