Функциональный анализ генов, кодирующих пептидазы у цианобактерии Synechocystis Sp. PCC 6803

• Автор: Паничкин, Владимир Борисович
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 132 с. : ил

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Цианобактерии как модельные объекты молекулярной генетики и генетической инженерии

2. Пептидазы прокариот

2.1. Классификация пептидаз

2.2. АТФзависимые пептидазы ii i

2.2.1. металлопептидаза

2.2.2. Сериновая пептидаза

2.2.3. Казеинолитичсскис пептидазы С1р

2.2.3.1 Пептидаза X

2.2.3.2. Другие белки С1рсемейства
2.3. Пептидазы семейства Е. i
2.4. Аминопептидазы и карбокенлтерминальные процессирующие пептидазы
3. Генетический контроль синтеза пептидаз у фотосинтезирующих организмов
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Штаммы бактерий и плазмиды
2. Среды и культивирование бактерий
3. Трансформация клеток Е. соН плазмидными ДНК
4. Трансформация клеток i
5. Сегрегация трансформантов цианобактерии i
6. Выделение хромосомной ДНК из i
7. Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. i кипячением
8. Очистка плазмидных ДНК
9. Электрофорез ДНК в агарозном геле
Ю.Элюция фрагментов ДНК из агарозного геля
.Полимеразная цепная реакция ПЦР
.Очистка ПЦР фрагментов
.Обработка Д1Ж эндонуклеазами рестрикции
.Затупление выступающих концов ДНК для последующего лигирования
.Лигирование ДНК
.Индуцирование хлороза у цианобактерии
.Определение содержания фотосинтстичсских пигментов
.Измерение выделения и поглощения кислорода
.Конъюгацнонные скрещивания
.Опредсление чувствительности клеток к ингибиторам
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Получение инсерционных мутантов i
2. Физиологобиохимический анализ инсерционных мутантов по пеитидазным генам , , рерР и утхО
3. Свойства мутанта, дефект ного по пептидазе С1рР2
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Цианобактерии являются прокариотическими организмами, обладающими окснгенным фотосинтезом, который не свойственен другим нрокариогам, а наличие уникального спектра фотосингетических пигментов отсутствие бактериохлорофнллов при наличии фикобилинов и хлорофилла а сближает эту группу с эукариотическими водорослями и высшими растениями. С одной стороны, процесс фотосинтеза у цианобактерий, структура фотосинтетического аппарата очень сходны с таковыми у высших растений и эукариотических водорослей , . С другой стороны, простота культивирования цианобактерий, способность к генетической трансформации v , , v , , iiv v, и наличие векторных систем Еланская и др. i . Таким образом, цианобактерии являются уникальным объектом для изучения молекулярных механизмов и генетического контроля регуляции фотосинтеза. Большинство исследований в области молекулярной генетики фотосинтеза в настоящее время проведены с использованием трех способных к генетической трансформации штаммов цианобактерий . РОС РСС i i i 2, далее обозначаемой как , . i ii 6 и i . В отличие от облигатно фотоавтотрофной цианобактерии , штаммы . ЧТО позволяет получать жизнеспособные мутанты дефектные по фотосинтезу i . Шестаков и др. , . Штамм одноклеточной цианобактерии i надцарство , царство i, класс i, порядок является модельным объектом молекулярной генетики и генной инженерии, так как геном этого организма полностью секвенирован . Данные о полной нуклеотидной последовательности генома позволяют концептуально выбирать для исследования любые ОРС открытые рамки считывания. С помощью методов молекулярной генетики и генной инженерии можно синтезировать искомые гены, клонировать их в удобных векторах и использовать для генналравленного мутагенеза. Анализируя фенотипические характеристики мутантов с инактивированными генами, можно приблизиться к пониманию функции того или иного гена в жизни клетки цианобактерии. Полученные данные можно использовать в качестве рабочей гипотезы при изучении функции гомологичных белков растений. Хотя механическая экстраполяция данных, полученных на цианобактериях на растительные объекты Например, белок у индуцируется светом . ii . i является светонезависимой . Эго свидетельствует о том, что сведения о гомологии генов не дают полного представления о сходстве их физиологических функций. Даже небольшие различия между сходными белками могут придавать им дополнительные свойства, что подтверждается наличием семейств генов. Так, например, у ii i, обнаружено шесть белков семейства, кодируемых ядерными генами и один белок, кодируемый хлоропластным геном. v . i . i . Ii . Таким образом, сочетание молекулярногенетических подходов, методов геномики и мутационных моделей позволяет анализировать функции различных белков, в частности пептидаз, которые играют важную роль в клеточном метаболизме. Термин пептидаза рекомендован Международным объединением биохимии и молекулярной биологии для всех протеолитичсских ферментов I, . Пептидазы Е. С. 3. На долю генов, ответственных за синтез пептидаз приходится около 12 в структуре геномов различных прокариотических организмов i , . По локализации расщепляемой пептидной связи в белке пептидазы подразделяют на эндопептидазы и экзопептидазы. По выполняемым в клетке функциям пептидазы можно разделить на две большие группы нсспсцифичсские, секретнруемые клетками пептидазы и специфические, участвующие в различных процессах клеточного метаболизма и выполняющие регуляторную роль в изменяющихся условиях окружающей среды.